pEGFP-NTCP稳定转染HEK293细胞系的建立及鉴定

陈 雅，李 静，张文政，罗 敏，傅晓钟，刘 亭

(1. 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550004；2. 贵州省药物制剂重点实验室，贵州 贵阳 550004；3.贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550004；4.国家苗药工程技术研究中心，贵州 贵阳 550004)

◇实验方法学◇

pEGFP-NTCP稳定转染HEK293细胞系的建立及鉴定

陈 雅1,3,4，李 静1,3，张文政1,3，罗 敏1,3，傅晓钟1,3，刘 亭2,3

(1. 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550004；2. 贵州省药物制剂重点实验室，贵州 贵阳 550004；3.贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550004；4.国家苗药工程技术研究中心，贵州 贵阳 550004)

目的 高效快速地建立稳定高表达钠离子-牛磺胆酸共转运多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)的HEK293细胞系。方法 构建可表达EGFP-NTCP融合蛋白的pEGFP-NTCP重组质粒，并利用FuGENE 6转染试剂将重组质粒转染至HEK293细胞中。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况，挑选转染细胞进行14 d G418筛选和单克隆培养，以获得稳定转染细胞株。用RT-PCR法、qRT-PCR法和Western blot技术检测稳定转染细胞及正常细胞中NTCP mRNA和蛋白的表达情况，并进一步用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)考察稳定转染细胞的牛磺胆酸摄取能力。结果 使用本文优化的方法，细胞转染率可达90%。RT-PCR、qRT-PCR、Western blot和牛磺酸摄取实验结果显示：相对于正常组，在荧光显微镜下呈绿色荧光的转染细胞；其NTCP表达均显阳性(P<0.01)；且稳定转染细胞的牛磺胆酸摄取能力明显升高(P<0.05)。结论 高效快速地建立了稳定高表达NTCP的HEK293细胞系，为胆酸衍生物摄取机制研究奠定了基础。

NTCP；EGFP；稳定转染；牛磺胆酸；HEK293细胞；高效快速

胆汁酸在肝脏中合成并储备在胆囊，在食物的刺激下被肠道吸收，至回肠末端被肠壁吸收后，经门静脉重新进入肝脏，被肝细胞摄取后再次分泌，进行肝肠循环[1]。研究发现，在肝肠循环中肝细胞对胆汁酸的摄取具有靶向性。而多数治疗肝病的药存在肝细胞富集能力差，对非靶器官毒性较大等缺点，因此可引入胆汁酸载体片段实现药物的肝靶向性富集。研究表明介导血液中的胆汁酸进入肝细胞的关键载体蛋白是位于肝细胞表面的钠离子-牛磺胆酸共转运多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)[1]。因此建立稳定高表达NTCP的HEK293细胞系，可为大规模筛选基于胆酸结构的具有肝靶向性的新药提供一个便利的模型。 在构建稳定转染细胞系的过程中，常常因为转染效率低、表达不稳定等因素，使得整个工作周期变得冗长，增加了大量的额外工作。尤其在表达离子通道蛋白的细胞系构建上，由于离子通道蛋白活性鉴定较为繁复，通常需要利用到液质联用等分析仪器，因此要选择表达效率最高的转染细胞尤为耗时耗力。鉴于此本文拟建立一种高效、方便的稳定高表达NTCP细胞系构建方法，不仅为肝靶向胆酸衍生物的筛选提供一个便利的工具，也旨在为他人建立稳定表达离子通道细胞系提供方法学参考。

1 材料

1.1 细胞 HEK293细胞株购自中国科学院细胞库。

1.2 试剂 DMEM培养基(批号8114031)、胎牛血清(FBS，批号1227694)、胰蛋白酶(批号J130049)均购于美国Gibco公司；质粒pEGFP-N1、NTCP DNA购于北京博迈德基因技术有限公司；质粒提取试剂盒(批号08114KA1)、G418(批号G8160)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号20160113)、牛血清白蛋白V(批号1112M055)、ECL Plus超敏发光液(批号20151020)、RIPA(批号20151020)均购于索莱宝公司；限制性内切酶EcoR Ι、BamH I(批号00187254)购于美国Thermo公司；鼠抗β-actin单抗(批号AB66132)购于巴傲得生物科技有限公司；牛磺胆酸(批号2015092601)购于Regent Sicence Industry Limited公司；RNA提取试剂盒(批号7020001018)、PVDF膜(批号K4SA1716L)均购于美国Millipore公司；FuGENE6转染试剂(批号0000164121)购于美国Promega公司；GAPDH引物上游5′-GGTCCTGGTTCTCATTCCT-3′，引物下游5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′；NTCP引物上游5′-GGTCCTGGTTCTCATTCCT-3′，引物下游5-AGAGTAATATCATGGCAAA-3′，由上海生工公司合成；膜蛋白提取试剂盒(批号BB150121)购于上海贝博生物公司；TRIzol(批号15596026)购于美国Ambion公司；T4 DNA连接酶(批号K6901BB)、TransScriptTMOne-Step RT-PCR SuperMix(批号RR047A)、逆转录试剂盒(批号AK5301)均购于日本TaKaRa公司；兔抗NTCP多克隆抗体(批号GR90832-34)、鼠抗EGFP单克隆抗体(批号GR191827-3)均购于美国Abcam公司；羊抗兔IgG抗体(批号C2301)、羊抗鼠IgG抗体(批号C3114)均购于上海Santa公司。

1.3 仪器 CO2细胞培养箱(美国Thermo Scientific公司)；超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；数显立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗仪器厂)；Allegra 64R 冷冻高速离心机(美国Beckman公司)；荧光倒置显微镜(日本尼康公司)；Acugity-TDQ型超高效液相色谱-串联质谱(美国Waters公司)；PowerPac Basic电泳仪、Modle 680酶标仪、垂直电泳槽、ChemiDoc XRS+凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 pEGFP-NTCP质粒的构建 将NTCP基因片段与pEGFP-N1载体分别用EcoR Ⅰ与BamH Ⅰ双酶切，切胶回收后用T4连接酶切产物。将连接产物转化至TOP10感受态大肠杆菌中，在0.1%卡拉霉素的LB琼脂平板上37℃培养12 h后，挑选单克隆至含0.1%卡拉霉素的LB培养基中，200 r·min-1、37℃培养14 h。然后用质粒提取试剂盒提取质粒。

2.2 pEGFP-NTCP质粒的鉴定 将提取的质粒EcoR Ⅰ与BamH Ⅰ双酶切后，挑取阳性克隆进行测序鉴定。

2.3 HEK293细胞的培养 用含10%胎牛血清的DMEM培养液在37℃、5% CO2中静置培养HEK293细胞，细胞达到80%汇合时，用胰蛋白酶消化传代。

2.4 确定G418筛选浓度 取生长到对数期的HEK293细胞，胰酶消化后计数，用完全培养基将细胞密度调整为2.4×108·L-1。在6孔板每孔中加入2 mL细胞悬浮液，于37℃，5% CO2条件下培养24 h。待细胞汇合度达到80%后，在6孔板中分别加入不同浓度抗生素G418(100、200、400、500、600、700、800 mg·L-1)。每隔2 d换液(含同浓度抗生素的培养液)1次，并观察细胞生长状态，选择5 d后大批量死亡、14 d后全部死亡的最低G418浓度为最佳筛选浓度。

2.5 pEGFP-NTCP稳定转染HEK293细胞系的构建

2.5.1 筛选最佳转染条件 取对数生长期的HEK293细胞，胰酶消化后，用完全培养基调整细胞密度为1.0×108、1.5×108、2.0×108、2.4×108·L-1，然后转至96孔板中，每孔加入100 μL，培养24 h。细胞汇合度分别为50%、60%、70%、80%。按FuGENE6转染试剂说明书配制转染工作液，使pEGFP-NTCP质粒与FuGENE6的比例分别达到6 ∶1、4 ∶1、3 ∶1、1.5 ∶1，并在不同汇合度的HEK293细胞中均加入不同比例的转染液。分别孵育24、30、48 h后荧光显微镜下观察。筛选出最佳转染条件。

2.5.2 挑选稳定转染HEK293细胞单克隆培养[2-3]取对数生长期的HEK293细胞，胰酶消化后，在6孔板中每孔加入2 mL密度为2.4×108·L-1的细胞悬浮液。培养30 h后，细胞达到80%汇合度，按FuGENE6转染试剂说明书配制pEGFP-NTCP质粒与FuGENE6比例为1 ∶3的转染液，将转染液加入到HEK293细胞中，孵育30 h后荧光显微镜下观察。选取转染效率为90%的细胞，将原培养液更换浓度为800 mg·L-1的G418的选择性培养液[5]，每隔2 d更换1次相同选择性培养液，孵育14 d后，基本得到含G418抗性HEK293细胞的克隆，挑选单个细胞克隆扩大培养，更换800 mg·L-1的G418培养液维持筛选。

2.6 RT-PCR鉴定NTCP mRNA的表达

2.6.1 RT-PCR测定稳定转染 HEK293细胞系中NTCP mRNA水平对稳定转染pEGFP-NTCP的HEK293细胞，利用总RNA提取试剂盒提取细胞中总RNA，通过逆转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA，以0.5 μg cDNA为模板，利用NTCP引物进行PCR扩增，25 μL扩增体系包括：上下游引物各0.5 μL，dNTP 2.0 μL，rTaq 0.2 μL，MgCl21.5 μL，10×buffer 2.5 μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火1 min，40个循环，72℃延伸10 min。以GAPDH作为内参，扩增后经琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2.6.2 qRT-PCR测定 NTCP mRNA水平以0.1 μg mRNA逆转录后的cDNA为模板，20 μL荧光定量PCR反应体系包括：1.0 μL cDNA，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，SYBR®Premix Ex TaqTMII 10 μL。PCR扩增程序同2.5.1。以GAPDH为内参，通过2(-△△Ct)方法分析数据。

2.7 Western blot测定NTCP、EGFP的蛋白表达 利用膜蛋白提取试剂盒提取稳定转染pEGFP-NTCP的HEK293细胞膜蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白含量。取等量膜蛋白变性进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后通过转膜装置将蛋白转印至PVDF膜，并将膜在5%的BSA中封闭2 h，分别加入兔抗NTCP多克隆抗体和鼠抗EGFP单克隆抗体4℃孵育14 h后，对应加入二抗羊抗兔IgG抗体和羊抗鼠IgG抗体室温下孵育2 h。用ECL进行检测，通过ChemiDoc XRS+系统成像。

2.8 pEGFP-NTCP稳定转染HEK293细胞系的功能鉴定

2.8.1 考察牛磺胆酸对HEK293细胞及稳定转染pEGFP-NTCP的HEK293细胞安全浓度范围 将对数生长期的HEK293细胞与稳定转染pEGFP-NTCP的HEK293细胞消化后，调整细胞密度为2.4×108·L-1。96孔板中每孔加入100 μL细胞悬浮液，孵育24 h后，在稳定转染pEGFP-NTCP的HEK293细胞孔中加入浓度分别为：25、50、100、200、400 μmol·L-1的牛磺胆酸。放入孵育箱孵育1 h后，吸弃药液，每孔加入100 μL培养基及5 μL MTS溶液孵育3 h，最后利用酶标仪检测490 nm波长处吸收值，按以下公式计算细胞存活率，考察安全浓度范围。

2.8.2 HEK293细胞及稳定转染pEGFP-NTCP的HEK293细胞对牛磺胆酸的摄取[4-5]参考已有文献[4]，并稍作调整。具体步骤如下，取汇合度为90%的HEK293细胞与稳定转染pEGFP-NTCP的HEK293细胞，胰酶消化，并调整细胞密度为2.4×108·L-1，在6孔板中每孔加入2 mL细胞悬浮液。孵育24 h后分别加入浓度为10、25、50、100、200 μmol·L-1的牛磺胆酸，并于培养箱孵育30 min后，用200 μL的RIPA裂解细胞，通过BCA试剂盒测定蛋白浓度，裂解液与甲醇的比值按1 ∶6混匀，13 800×g离心20 min，沉淀蛋白，最后通过UPLC-MS/MS测定牛磺胆酸的摄取量，计算正常HEK293细胞与稳定转染pEGFP-NTCP的HEK293细胞中单位蛋白药物的摄取量。

2.9 色谱与质谱条件 色谱柱Waters Van Guard BEH C 18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)柱，柱温：45℃，流速：0.35 mL·min-1，进样体积：2.0 μL，流动相：A：含0.1%甲酸的乙腈，B：含0.1%甲酸的水，梯度洗脱：5% A(0～1.5 min)，5%～100% A(1.5～4 min)，5% A(4～6 min)。锥孔电压为：45 V，质谱采用选择离子监测(SIR)，以格列本脲为内标，用于定量正离子对(m/z)：515.71。

3 结果

3.1 pEGFP-NTCP质粒的鉴定 琼脂糖凝胶电泳显示：pEGFP-NTCP质粒的主带在5.7 kb左右，如Fig 1所示，与理想大小相符合。pEGFP-NTCP质粒的EcoR Ⅰ与BamH Ⅰ双酶切产物亦符合理论大小，如Fig 2所示。将阳性克隆送出测序，结果与GenBank(L21893.1)报道的NTCP序列相符，说明质粒pEGFP-NTCP构建成功。

3.2 NTCP稳定转染细胞模型的建立与鉴定 质粒通过FuGENE 6转染试剂转染至HEK293细胞后，利用浓度为800 mg·L-1的G418筛选成功转染的细胞，d 5细胞开始大量死亡，d 14后大部分细胞死亡，如Fig 3所示。基本得到G418抗性HEK293细胞的克隆，挑选单克隆继续进行筛选扩增。

Fig 1 Gel electrophoresis of pEGFP-NTCP recombinant plasmid

M:DNA Marker 5 000； 1:pEGFP-NTCP recombinant plasmid

Fig 2 Identification of recombinant plasmid digested by EcoR Ⅰand BamH Ⅰ

M:DNA Marker 2 000； 1:pEGFP-NTCP recombinant plasmid

3.2.1 荧光显微镜鉴定稳定转染 pEGFP-NTCP的HEK293细胞系在荧光显微镜下显绿色荧光，如Fig 4所示。说明稳定转染pEGFP-NTCP的HEK293细胞表达含绿色荧光的融合蛋白。

3.2.2 RT-PCR鉴定NTCP转录的表达 琼脂糖凝胶电泳结果显示，在GAPDH表达量相同时，HEK293细胞组扩增不出目的条带，而pEGFP-NTCP稳定转染HEK293细胞可扩增出175 bp的目的片段，如Fig 5所示。qRT-PCR结果显示，与正常组相比，pEGFP-NTCP稳定转染HEK293细胞中的NTCP mRNA表达明显升高，且差异有显著性(P<0.01)，如Tab 1所示。说明外源性基因已整合到HEK293细胞中，且能转录出相应的mRNA。

CellNTCPmRNAStabletransfectedHEK293cells14939.56±1034.98**HEK293cells1.00±0.06

**P<0.01vsHEK293 cells

3.2.3 Western blot鉴定NTCP、EGFP特异性蛋白的表达 以HEK293细胞作为阴性对照，稳定转染pEGFP-NTCP的HEK293细胞的NTCP特异性蛋白表达呈阳性，且EGFP特异性蛋白表达也同时呈阳性，如Fig 6所示，与RT-PCR结果相符。说明稳定转染pEGFP-NTCP的HEK293细胞系构建成功。

Fig 3 Cell morphology(×100) A:Culture for first day; B:Culture for fifth day;C:Culture for fourteenth day

Fig 4 Cell morphology under fluorescence microscope(×100)

Fig 5 Analysis of NTCP mRNA by RT-PCR

M：DNA Marker 5 000;1：NTCP from RNA of HEK293 cells;2:NTCP from RNA of stable transfected HEK293 cells;3:GAPDH of HEK293 cells;4:GAPDH of stable transfected HEK293 cells

Fig 6 Western blot

1:Stable transfected HEK293 cells; 2：HEK293 cells

3.3 pEGFP-NTCP稳定转染HEK293细胞功能鉴定

3.3.1 牛磺胆酸的细胞安全浓度范围 实验结果表明，受试化合物浓度在400 μmol·L-1以下对HEK293细胞及转染pEGFP-NTCP的HEK293细胞均没有毒性作用(P>0.05)，如Tab 2所示。因此研究HEK293细胞及稳定转染pEGFP-NTCP的HEK293细胞的牛磺胆酸摄取能力时，可选择作用时间1 h之内、受试化合物浓度在400 μmol·L-1以下的条件进行实验。

3.3.2 牛磺胆酸对HEK293细胞及稳定转染pEGFP-NTCP的HEK293细胞的摄取 分别给浓度为10、25、50、100、200 μmol·L-1的牛磺胆酸至HEK293细胞及稳定转染pEGFP-NTCP的HEK293细胞中，测定牛磺胆酸的摄取量。实验结果表明pEGFP-NTCP稳定转染HEK293细胞对牛磺胆酸的摄取从浓度50 μmol·L-1开始趋于饱和，且稳定转染pEGFP-NTCP的HEK293细胞对牛磺胆酸的摄取明显高于HEK293细胞(P<0.05)，如Fig 7所示，说明转染pEGFP-NTCP的HEK293细胞系模型构建成功。

Fig 7 Concentration dependence of taurocholate uptake

**P<0.01vscontrol group. Uptake of taurocholate into stable transfected HEK2932(■),Uptake of taurocholate into HEK2932(●)

4 讨论

鉴定稳定转染细胞系是否构建成功的重要标志是外源基因是否表达以及目的蛋白是否具有活性。本文构建了一个能表达NTCP载体蛋白和EGFP荧光蛋白的稳定转染细胞系，为了验证该细胞是否构建成功，本文利用荧光显微镜观察、RT-PCR、qRT-PCR、Western blot和胆酸摄取实验等方法来进行鉴定。实验表明，细胞系在荧光显微镜下显绿色荧光；RT-PCR、qRT-PCR、Western blot表明NTCP和EGFP蛋白在转染细胞中得到了表达；并且胆酸摄取实验证实所表达的NTCP 目的蛋白具有活性。以上实验说明pEGFP-NTCP稳定转染HEK293细胞系构建成功。

HEK293细胞是常用于研究外源基因的细胞株，具有转染效率高、极少表达细胞外配体所需的内生受体等特点[6]；FuGENE 6转染试剂是一种非脂质体转染试剂，与其它试剂相比具有更高的转染效率、毒性更低等优势。因此实验选用HEK293细胞作为宿主细胞，FuGENE 6作为转染试剂来筛选最佳转染条件。实验发现转染效率随细胞汇合度的增加而增加，且细胞汇合度达到80%时转染效率最佳；当FuGENE 6转染试剂与pEGFP-NTCP质粒浓度比例在3 ∶1时转染效率最佳；pEGFP-NTCP质粒转染HEK293细胞30 h转染效率达到最佳，48 h细胞明显部分死亡。因此本实验选用细胞融合度为80%，FuGENE 6转染试剂与转染质粒浓度比例为3 ∶1，转染时间为30 h进行转染。实验表明，在该条件下，转染效率可达90%。此外，本文还发现，当HEK293细胞形态缩小且生长伪足时，会降低转染效率。

Tab 2 Toxic effects of taurocholic acid on cells after 1 ±s，n=3)

增强的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)是绿色荧光蛋白(green fluorescent protein GFP)的突变体[7]，其荧光强度比GFP高6 倍以上，比GFP更适合作为报告基因监测外源基因表达[8]。为了提高转染效率，并快速挑选出蛋白表达效率高的单克隆，本文构建了能表达EGFP-NTCP融合蛋白的pEGFP-NTCP重组质粒，并转入HEK293细胞，通过比较绿色荧光强度来挑选表达效率最高的单克隆进行扩增培养，成功建立稳定表达NTCP的HEK293细胞系。并且牛磺胆酸的摄取实验数据显示，稳定转染细胞对牛磺胆酸的摄取量明显高于正常细胞，表明EGFP-NTCP融合蛋白具有NTCP特异性介导的运输功能。本文使用的方法解决了构建稳定转染细胞时存在的转染效率低、目的蛋白表达不稳定、目的蛋白活性鉴定繁复等问题，提升了构建稳定表达NTCP转染细胞的工作效率。

综上所述，建立pEGFP-NTCP稳定转染HEK293细胞便于高效快速得到稳定高表达NTCP蛋白的转染细胞系，且不影响NTCP特异性介导的运输功能，为胆酸衍生物开发及研究奠定了基础。

(致谢：感谢傅晓钟老师与刘亭老师的细心指导，感谢李静同学、罗敏同学和张文政同学的热心帮助。)

[1] Schaap F G,Trauner M,Jansen P L.Bile acid receptors as targets for drug development[J].NatRevGastroenterolHepatol,2014,11(1):55-67.

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[3] Shimomura O,Johnson F H,Saiga Y,et al.Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea[J].JCellCompPhysiol,1962,59:223-7.

[4] Zhou S M,Meng F G,Dani-an H G,et al.Green fluorescent protein and its application[J].ProgrBiotechnol,1999,19(2):56-9.

[5] Kain S R.Green fluorescent protein(GFP):applications in cell-based assays for drug discov[J].DrugDiscoveryToday,1999,4(7):304-12.

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Abstrate:Aim To construct HEK293 cell line with stable and high expression of sodium taurocholate cotransporting polypeptide(NTCP) efficiently and rapidly.Method Vector expressing EGFP-NTCP fusion protein was constructed and verified by DNA sequencing. The pEGFP-NTCP expression vector was transfected into HEK293 cells by FuGENE 6 transfection reagent. The transfected cells with high expression of green fluorescent protein were selected using fluorescence microscope for screening of G418 for 14 days to obtain cell lines stably and highly expressing NTCP. NTCP expression was detected by RT-PCR, qRT-PCR, Western-blot and the uptake experiment of taurocholic acid.Result RT-PCR, qRT-PCR, Western-blot and the uptake experiment revealed that compared to the control cells, the expression of NTCP was significantly positive(P<0.01) in stable trans-fected cells showing green fluorescence(P<0.05).Conclusion The HEK293 cell line with stable and high expression of NTCP has been established efficiently and rapidly, which provides a cellular model for the study of the mechanism of the uptake of bile acid derivatives.

Establishment and identification of HEK293 cell lines with stable and high expression of NTCP

CHEN Ya1,3,4, LI Jing1,3,ZHANG Wen-zheng1,3, LUO Min1,3, FU Xiao-zhong1,3,LIU Ting2,3

(1.EngineeringResearchCenterfortheDevelopmentandApplicationofEthnicMedicineandTCM(MinistryofEducation),Guiyang550004,China; 2.ProvincialKeyLaboratoryforPharmaceuticalPreparations,Guiyang550004,China;3.SchoolofPharmacy,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China;4.NationalEngineeringResearchCenterofMiao′sMedicines,Guiyang550004,China)

NTCP; EGFP; stable transfection; taurocholic acid; HEK293 cells; efficient and fast

时间：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.050.html

2016-06-08，

2016-08-22

国家自然科学基金资助项目(No 81460523)；贵州省优秀青年科技人才培养对象专项基金(No 2013-45号)；贵州省社会发展攻关计划项目(No 2013-3031号)；贵州省中药现代化科技产业研究开发专项(No 2013-4001号)；贵州省科学技术基金(No 黔科合J字[2014]2018号)

陈 雅(1991-)，女，硕士生，研究方向：药物化学及药理学，E-mail: 635959626@qq.com； 傅晓钟(1972-)，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：药物化学，通讯作者，E-mail: xiaozhong_fu@sina.com； 刘 亭(1981-)，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：药理学，通讯作者，E-mail: 1586740@qq.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.025

A

1001-1978(2016)12-1767-06

R282.74；R322.61；R341；R394.2