棉粕固态发酵菌种的筛选及复配

■王云超 米 军 刘孟健 赵永红 朱金珍 姚 峻

(中粮（昌吉）粮油工业有限公司，新疆昌吉 831100)

目前国内大多发酵棉粕工业生产受设备限制，物料经常置于发酵池或呼吸袋内进行发酵，其共同的特点为兼性厌氧环境或绝对厌氧环境发酵，所以对发酵菌种的筛选及配比提出了更加苛刻的要求[1]。通过以往的生产经验，可从芽孢杆菌属、乳酸菌属和酵母属种中分别筛选出优良菌株，作为棉粕发酵的生产菌种，其主要作用分别为降解大分子蛋白、游离棉酚、降低pH值及改善产品风味、提高适口性[2-4]。

本章试验结合目前流行的固态兼性厌氧发酵棉粕工艺，以相对应的指标分别对9种芽孢杆菌、9种乳酸菌和9种酵母菌进行单菌种筛选，得到兼性厌氧高产蛋白酶芽孢杆菌、产酸乳酸菌和高效降解游离棉酚酵母菌；随后对已筛单菌种进行正交试验确定其最佳配比；最后按最优配比复配菌种进行棉粕发酵试验，检测样品相关指标。本试验为棉粕混合菌种发酵剂相关产品的开发奠定了良好的基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌种

枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌，由中粮（昌吉）粮油工业有限公司研发中心提供。

1.1.2 试验培养基

枯草芽孢杆菌培养基：牛肉膏1.0 g/l、氯化钠0.5 g/l、蛋白胨 1.0 g/l、琼脂 15.0 g/l，pH 值 7.2，121～126℃灭菌30 min。

乳酸菌培养基：牛肉膏10.0 g/l、蛋白胨10.0 g/l、酵母浸膏5.0 g/l、葡萄糖5.0 g/l、磷酸氢二钾2.0 g/l、乙酸钠 5.0 g/l、硫酸镁 0.2 g/l、柠檬酸铵 2.0 g/l、硫酸锰0.05 g/l、吐温80 1.0 g/l、琼脂20.0 g/l，pH值6.8，121～126℃灭菌30 min。

酵母菌培养基：麦芽浸粉1.0 g/l、葡萄糖1.0 g/l、琼脂20.0 g/l，在121～126 ℃灭菌30 min。

复合菌培养基：糖蜜40.0 g/l、蛋白胨10.0 g/l、葡萄糖 1.0 g/l、硫酸镁 0.2 g/l、磷酸氢二钾 0.5 g/l，121～126 ℃灭菌30 min[5]。

1.2 试验方法

1.2.1 单菌种初筛

单菌种的筛选分为初筛和复筛，均为单因素试验。单菌种的初筛在相对应的选择培养基中进行；单菌种的复筛在棉粕中进行，其棉粕底物的配比为棉粕∶玉米=9.5∶0.5，料水比1∶0.8。细菌培养条件为：37 ℃、48 h；酵母菌培养条件为：30 ℃、72 h。

其中，高产蛋白酶芽孢杆菌的筛选指标为：产酶性能、粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、小肽含量、活菌总数、风味评分。乳酸菌的筛选指标：pH值、有机酸含量、活菌总数、风味评分。酵母菌的筛选指标：游离棉酚含量、粗蛋白、酸溶蛋白、风味评分。

1.2.1.1 高产蛋白酶芽孢杆菌菌种的初筛

分别从待选芽孢杆菌菌种斜面中挑取一环接种于10 ml牛肉膏蛋白胨培养基中培养24 h作为菌种液。然后将其稀释至浓度10-7cfu/ml，并吸取100 μl加入酪蛋白筛选培养基中进行涂布。此过程分别制作2组，每组3个重复，其中一组好氧培养72 h，另一组进行厌氧培养72 h，最后检测其水解圈直径D（mm）和菌落直径d（mm）。

1.2.1.2 乳酸菌菌种的初筛

分别从待选乳酸菌菌种斜面中挑取一环接种于10 ml MRS肉汤培养基中培养24 h作为菌种液。然后取1 ml接入200 ml MRS肉汤培养基中培养72 h，最后检测pH值、有机酸、活菌数、发酵风味等指标，每组处理3个重复。

1.2.1.3 酵母菌菌种的初筛

分别从待选酵母菌种斜面中挑取一环接种于10 ml、0.2%醋酸棉酚YPD液体培养基中培养48 h作为菌种液。然后分别于0.2%和0.4%的醋酸棉酚YPD固体培养皿上进行点种，培养96 h，检测其菌落生长状况。菌落最优为+++，菌落没有生长为-，每组处理3个重复，取其平均值。

1.2.2 单菌种复筛

将已初筛的菌种进行斜面保存。然后分别从菌种斜面挑取一环接种于10 ml对应的液体培养基中作为菌种液。细菌培养48 h、真菌培养72 h后，取菌种液5 ml均匀喷洒至500 g棉粕底物中，并按料水比使其物料充分搅拌均匀，30℃固态厌氧静止发酵72 h，最终检测各样品对应指标，每组处理3个重复。

1.2.3 复合菌种最优配比

复合菌种配比优化为3因素2水平正交试验。其所选用底物配比为棉粕∶玉米=9.5∶0.5；其中粗蛋白含量为45.81%，料水比1∶0.8，发酵温度30℃，发酵时间72 h，固态厌氧静置发酵。

如表1所示，按照此表3因素2水平的正交方案设计试验。将已筛选出的菌种按计划表进行复配，使各组复配菌种液分别与无菌水按比例混匀，接入2 kg底物中，30℃固态厌氧静止发酵72 h，最终测其各项指标。

表1 复配菌种比例正交方案设计

1.3 指标检测

粗蛋白含量测定：参照GB/T5009.5-1985的方法进行；酸溶蛋白含量测定：参照QB/T2653-2004的方法进行；有机酸含量测定：参照GB/T5009.157-2003的方法进行；小肽含量测定：参照GB/T 22492-2008的方法进行；pH值：采用pH酸度计进行测定；活菌总数：参照GB13093-91的方法进行[6]；游离棉酚含量：参照GB/T 5009.148-2003的方法进行；菌落生长情况测定：菌落生长情况采用工具测量菌落直径，每个培养皿所有菌落测量取平均值，菌落直径超过2 cm记做“+++”，菌落直径在1～2 cm记做“++”，菌落直径在0～1 cm记做“+”，没有菌落生长记做“-”；

风味评分方法：风味评分的测定采用-5至5分制，-5分为刺鼻恶臭难以接受、5分为酸香适宜风味令人愉快。评分人员选用10名具有相关风味评价经验人员，每人评分后取平均值[7]。

1.4 数据处理

应用Office EXCEL初步整理数据及SPSS13.0统计软件对数据进行方差分析及显著性检验，P＜0.05为差异显著，P＞0.05为差异不显著；数据结果以“平均值±标准误”表示。

2 结果与讨论

2.1 单菌的筛选

2.1.1 兼性厌氧芽孢杆菌的筛选

表2、表3分别为有氧与厌氧条件下不同芽孢杆菌菌种的菌落直径与酪素水解圈的大小情况。表2可见，在有氧培养条件下，3种芽孢杆菌均较好生长并能产生抑菌圈，其中KC-1、KC-2、LZ-2、LZ-3的透明圈直径达到了10 mm以上，且直径比（D/d）达到了3.0以上，表现出较好产蛋白酶特性；在厌氧厌氧培养条件下，只有KC-1、KC-2、LZ-2、DY-3出现菌落生长，其中KC-1与LZ-2的透明圈直径达到了10 mm以上，且直径比（D/d）达到了4.5以上，表现出较强的厌氧环境生长能力，说明2种芽孢杆菌在厌氧条件下产蛋白酶特性良好。综上所述，KC-1与LZ-2在有氧和厌氧条件下均能较好生长并有相似产酶特性，将其作为复筛菌种。

表2 初筛芽孢杆菌菌种好氧培养结果

表3 初筛芽孢杆菌菌种厌氧培养结果

表4为KC-1与LZ-2的复筛结果。表4可见，KC-1发酵底物的4项指标与对照组相比均差异显著(P＜0.05)，并且经KC-1发酵的底物中粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、小肽含量及活菌总数均高于LZ-2，其中两试验组中的酸溶蛋白含量及活菌总数差异显著。由此可以看出，在厌氧发酵条件下，KC-1产出的蛋白酶更适合棉粕高分子蛋白的水解，形成更多的低分子酸溶蛋白，并且其自身所需营养物质和代谢水平较低。从发酵后底物的风味来看，虽然两种芽孢杆菌均产生了类似挥发性氨类、硫化氢类等不愉快的挥发性物质，但KC-1的风味评价优于LZ-2，对发酵棉粕风味影响较小。在复筛试验中发现，LZ-2发酵后的棉粕出现粘黏、粘丝的情况，这对后续的产品工艺造成不利影响。综上所述，KC-1作为兼性厌氧芽孢杆菌的筛选菌种。

表4 复筛芽孢杆菌菌种固态厌氧发酵样品结果

2.1.2 产酸乳酸菌的筛选

表5为乳酸菌属的初筛结果。如表所示，从产酸性能上看，ZR-1、ZR-2、ZR-3总体的产酸性能高，有机酸均达到2.5%以上，pH值在3.2～3.51之间，使得发酵条件pH值过低、酸度过高；BR-1、BR-2、BR-3总体的产酸性能低，有机酸含量均在2.0%以下，pH值在4.38以上，不能满足菌种产酸要求；SS-1、SS-2、SS-3总体产酸性能居中，有机酸含量和pH值分别介于2.0%～2.2%和3.42%～3.65%之间，可以满足菌种产酸要求。从风味评分上来，虽然ZR的产酸性能高，但其代谢产物的风味物质酸味刺鼻，令人不快，菌种不能达到改善产品风味的要求；而BR的挥发性风味物质酸香适中，能感受到菌种发酵后的挥发性酯类物质；SS的pH值指标适中，并且其挥发性风味有轻微酯香，风味柔和不刺鼻，菌种可以达到改善产品风味的要求。因此初筛菌种为SS-1、SS-2、SS-3。

表6为乳酸菌的复筛结果。从产酸性能上说，SS-1、SS-2、SS-3的有机酸含量都为1%～2%，其中SS-1有机酸含量最高，为1.73%，SS-3有机酸含量最低，为1.26%，SS-2的有机酸含量居中，为1.62%，此三组差异不显著，均能满足菌种产酸要求；从活菌总数来说，发酵后SS-2的活菌数最高，为4.95×108cfu/g、SS-3的活菌数最低，为9.58×107cfu/g，3组的活菌总数差异不显著；从风味评分来说，3种乳酸菌风味相差不大，但SS-1有轻微的刺鼻性挥发性酸，SS-3挥发性酸味较低，SS-2具有明显的挥发性酸香，适合底物风味物质的呈现。综上所述，由三组试验结果相比，SS-2的产酸性能居中，在活菌总数和挥发性风味上优于SS-1、SS-3，因此将SS-2作为乳酸菌的筛选菌种。

表5 初筛乳酸菌菌种液体静置培养结果

表6 复筛乳酸菌菌种固态发酵样品结果

2.1.3 高效降解游离棉酚酵母菌的筛选

表7为高效降解游离棉酚酵母菌的筛选结果。如表所示JS-1、JS-2、JS-3在0.2%和0.4%醋酸棉酚YPD筛选培养基上都有良好的生长性能，说明棉酚对其生长的抑制较小，脱酚能力较强；NJ-2、NJ-3、PJ-2虽然能在0.4%醋酸棉酚YPD筛选培养基有所生长，但单菌落直径较小、菌落形态不规则，说明棉酚对其生长的抑制较大，脱酚能力不强。NJ-1、PJ-1、PJ-3在0.4%醋酸棉酚YPD筛选培养基上没有生长，不能做作为降解游离棉酚的酵母菌种。

表7 醋酸棉酚YPD固体培养基筛选菌种生长情况

表8为复筛酵母菌菌种固态发酵样品结果。从游离棉酚含量来看，7个样品均低于对照组，说明7种酵母菌菌种均有降解游离棉酚的能力，其中JS-1的降解能力最高，物料发酵后其游离棉酚含量为370.18 mg/kg，除JS-3以外，显著低于其他组；从粗蛋白含量来看，发酵后JS-1和PJ-2的含量较高，分别为48.62%和48.74%，除PJ-1以外，显著高于其他组；从酸溶蛋白含量来看，JS-1的含量最高，为12.80%，显著高于其他组；从风味评分来看，JS-1、NJ-2、PJ-1、PJ-2的风味较好，均在3分以上，均有明显的醇和酯的挥发性风味，可以达到改善产品挥发性风味的效果。综上所述，虽然JS-3和PJ-1分别在降解游离棉酚和提高粗蛋白含量的效果较强，但降解棉粕中大分子蛋白的性能较低；JS-1降解游离棉酚性能最强，且其他指标均能满足发酵需要。综上所述，确定JS-1作为发酵棉粕的酵母菌种。

表8 复筛酵母菌固态发酵样品检测结果

2.2 复配菌种最优配比确定

表9为复配菌种配比正交试验结果表，通过表1的3因素2水平试验设计，分别测定了各组的游离棉酚、酸溶蛋白、有机酸、活菌数和风味指标，通过综合分析来确定复配菌种最优配比。

分析游离棉酚指标，影响其指标的因素从大到小依次为KC-1＞JS-1＞SS-2，最佳配比方案为：KC-1∶SS-2∶JS-1=2∶1∶2，即按此比例复配菌种发酵棉粕后游离棉酚含量最低；分析酸溶蛋白指标，影响其指标的因素从大到小依次为KC-1＞SS-2＞JS-1，最佳配比方案为：KC-1∶SS-2∶JS-1=2∶1∶2，即按此比例复配菌种发酵棉粕酸溶蛋白含量最高；分析有机酸指标，影响其指标的因素从大到小依次为SS-2＞KC-1＞JS-1，最佳配比方案为：KC-1∶SS-2∶JS-1=1∶2∶2，即按此比例复配菌种发酵棉粕有机酸含量最高；分析活菌数指标，响其指标的因素从大到小依次为SS-2＞KC-1＞JS-1，最佳配比方案为：KC-1∶SS-2∶JS-1=2∶1∶2，即按此比例复配菌种发酵棉粕活菌总数最高；分析风味指标，影响其指标的因素从大到小依次为SS-2＞KC-1＞JS-1，其最佳配比方案为：KC-1∶SS-2∶JS-1=2∶1∶2。

表9 复配菌种配比正交试验结果（3因素2水平）

通过有机酸和活菌数指标分析，由于底物是通过厌氧的条件发酵，有利于乳酸菌的生长，此条件不仅会产生过多有机酸影响产品风味，还会过快降低发酵环境pH值，抑制芽孢杆菌特别是酵母菌的生长，所以有机酸并不是越高越好，影响有机酸的最大因素为乳酸菌，所以为了适当降低有机酸含量，可适当降低乳酸菌比例。通过发酵棉粕最重要的游离棉酚指标、酸溶蛋白指标及风味指标综合分析，棉粕发酵的最优复合菌种配比即为：KC-1∶SS-2∶JS-1=2∶1∶2。

2.3 复配菌种棉粕固态发酵样品主要指标检测

通过按最佳配比的复配菌种对棉粕进行固态厌氧发酵后，如表10所示，主要指标分别为：游离棉酚含量213.36 mg/kg、粗蛋白含量48.21%、酸溶蛋白含量13.40%、小肽含量5.60%、有机酸含量1.68%、pH值4.84、活菌数8.20×108cfu/g，发酵风味酸香适宜令人愉悦，其发酵棉粕各项指标均较理想。

表10 复配菌种的棉粕固态发酵样品检测结果

3 结论

本试验结合目前流行的固态兼性厌氧发酵棉粕工艺，以相对应的指标分别对9种芽孢杆菌、9种乳酸菌和9种酵母菌进行筛选，随后对已筛菌种进行正交试验确定其最佳配比，最后按最优配比复配菌种进行棉粕发酵小试，检测其相关指标。试验结果：①单菌种筛选出芽孢杆菌KC-1、乳酸菌SS-2、酵母菌JS-1作为复配菌种。②复配菌种最佳配比为：KC-1∶SS-2∶JS-1=2∶1∶2。③按最优配比复配菌种发酵棉粕后的主要指标分别为：游离棉酚含量213.36 mg/kg、粗蛋白含量48.21%、酸溶蛋白含量13.40%、小肽含量5.60%、有机酸含量1.68%、pH值4.84、活菌数8.20×108cfu/g、发酵风味酸香适宜令人愉悦，各项指标均较为理想。