高效液相色谱法测定复方混悬滴眼液中苯扎氯铵含量

杨龙华，宿 洁，陈 涛，卢京光

（山东省青岛市食品药品检验检测中心，山东 青岛 266071)

高效液相色谱法测定复方混悬滴眼液中苯扎氯铵含量

杨龙华，宿 洁，陈 涛，卢京光

（山东省青岛市食品药品检验检测中心，山东 青岛 266071)

目的 建立测定氯替泼诺妥布霉素复方混悬滴眼液中防腐剂苯扎氯铵含量的高效液相色谱（HPLC）法。方法 色谱柱为Waters Spherisorb S5 CN柱（250 mm×4．6 mm，5 m），流动相为0．1%磷酸溶液－乙腈－四氢呋喃（52∶39∶15），流速为1．5 mL／min，检测波长为216 nm，柱温为30℃。结果 苯扎氯铵质量浓度在0．04～0．20 g／L（r＝0．999 9，n＝5）范围内与峰面积线性关系良好，平均回收率为100．22%，RSD为0．59%(n＝9）。结论 该方法简便、灵敏，色谱峰分离度良好，结果准确、可靠，可用于氯替泼诺妥布霉素混悬滴眼液的质量控制。

高效液相色谱法；苯扎氯铵；混悬滴眼液；防腐剂；含量测定

氯替泼诺妥布霉素复方混悬滴眼液临床主要用于治疗对甾体激素敏感及细菌感染的眼部炎症。该复方混悬滴眼液中联合苯扎氯铵和乙二胺四乙酸二钠（EDTA）作为防腐系统，以提高该制剂的稳定性，已有文献对该制剂中的EDTA含量测定方法进行了研究[1]。苯扎氯铵是由3种正烷烃基（n－C12H25，n－C14H29，n－C16H33）取代二甲基苄基氯化铵组成的同系物混合物，在水溶液中离解成阳离子活性基团，具有杀菌作用，3种同系物的杀菌特性不同。苯扎氯铵为国内有药用标准的常用防腐剂，眼科常用量0．003%～0．020%。在0．1%浓度下，苯扎氯铵可引起变态反应性结膜炎、视力减退、接触性皮炎等不良反应，故控制氯替泼诺妥布霉素混悬滴眼液中苯扎氯铵的含量十分必要。目前，已有文献报道，单方滴眼液中苯扎氯铵的含量测定方法[2－3]，但无复方混悬剂中苯扎氯铵含量测定方法的报道。本研究中建立了测定氯替泼诺妥布霉素混悬滴眼液中苯扎氯铵含量的反相高效液相色谱(RP－HPLC)法，现报道如下。

1 仪器与试药

LC－2010C型高效液相色谱－紫外仪和CLASS VP型色谱工作站（日本岛津公司）。苯扎氯铵（中国药品生物制品检定所，批号为061067524A，标示量为100 g／L，含量为99．10%）；氯替泼诺妥布霉素混悬滴眼液（美国博士伦股份有限公司，批号为分别为107781，117621，127001）；乙腈、四氢呋喃、氯丁烷为色谱纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2．1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Waters Spherisorb S5 CN柱（250 mm× 4．6 mm，5 μm）；流动相：0．1%磷酸溶液－乙腈－四氢呋喃（52∶39∶15，用1 mol／L氢氧化钠溶液调节pH至3．5，每2 000 mL流动相溶液加氯丁烷25 mL）；流速：1．5 mL／min；检测波长：216 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL。取对照品溶液和供试品溶液适量，按拟订色谱条件进样分析，记录色谱图，见图1。对照品溶液色谱峰流出顺序为 C12，C14，C16同系物；C12和 C14同系物分离度为4．5；C12同系物和样品基质峰（相对于C12同系物峰的相对保留时间约为0．14）分离度为14．9。

2．2 溶液制备

精密量取苯扎氯铵对照品1．0mL，置100mL容量瓶，加水稀释至刻度，摇匀，得对照品贮备溶液(0．991 0 g／L)。量取对照品贮备液适量，加水制成每1 mL中约含苯扎氯铵0．1 mg的溶液，作为对照品溶液。取氯替泼诺妥布霉素混悬滴眼液（批号为 107781）轻轻搅拌3 min，滤过，取滤液作为供试品溶液。

图1 高效液相色谱图

2．3 方法学考察

线性关系考察：精密量取2．2项下对照品贮备溶液（0．991 0 g／L）2．0，4．0，5．0，8．0，10．0 mL，分别置50 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得标准曲线溶液(苯扎氯铵质量浓度分别为 0．039 64，0．079 28，0．099 10，0．158 56，0．198 2 g／L)，精密量取各混合标准曲线溶液20 μL，按拟订色谱条件进样分析，以各标准曲线溶液质量浓度（C，g／L）为纵坐标、C12，C14，C163个同系物峰面积（A）为横坐标进行线性回归，得回归方程C＝9．073 0×10－8A＋3．659 6×10－5，r＝0．999 9 (n＝5）。结果表明，苯扎氯铵质量浓度在0．04～0．20 g／L范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取同一对照品溶液，按拟订色谱条件连续进样6次进行测定。结果苯扎氯铵色谱峰面积的RSD为0．1%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，按拟订色谱条件分别于0，2，4，8，12，24 h时进样测定峰面积。结果苯扎氯铵色谱峰面积的 RSD为0．6%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

加样回收试验：精密量取对照品贮备液（0．9910 g／L）0．25，0．5，1．0 mL各3份，分别置9个10 mL容量瓶中，并分别加入已知含量且经搅拌过滤的混悬滴眼液样品5．0 mL（批号为117621，标示量为0．1 g／L，含量为99．84%），加水稀释至刻度，摇匀，依法进样测定，计算回收率。结果见表1。

2．4 样品含量测定

取样品3批，分别轻轻搅拌3 min后过滤，取滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，将供试品溶液的峰面积代入标准曲线方程计算含量。结果见表2。

表1 苯扎氯铵加样回收试验结果（n＝9）

表2 样品含量测定结果（%）

3 讨论

检测波长选择：以水作为空白溶液，在200～300 nm波长范围内扫描，结果在208，263 nm波长处均有最大吸收。因苯扎氯铵在滴眼液中含量较低，在263 nm波长测定其响应值较低，而208 nm波长接近末端吸收，检出杂质较多，影响苯扎氯铵同系物色谱峰与相邻色谱峰的分离度。本试验最终选择216 nm波长作为检测波长，可使苯扎氯铵同系物色谱峰与相邻色谱峰的分离度达到要求，并能准确测定苯扎氯铵的含量。

流速和柱温选择：苯扎氯铵是同系物组成的混合物，有多个主峰，为了利于快速分析，对流速和柱温进行了优化，最终选择流速为1．5 mL／min，柱温为30℃。

计算方法选择：苯扎氯铵对照品说明书未给出各同系物的含量比例，仅给出同系物（n－C12H25，n－C14H29，n－C16H33）标示量为100 g／L，含量为99．10%，因此按外标法选择以C12，C14，C163个同系物峰面积之和计算混悬滴眼液中苯扎氯铵的含量。虽然对照品溶液和供试品溶液色谱图中均出现C18色谱峰，但含量低于0．1%，因此计算时可忽略不计。

[1]薛 琦，杨龙华．反相离子对高效液相色谱法测定混悬滴眼液中乙二胺四乙酸二钠含量[J]．中国药业，2012，21（1）：24－25．

[2]韩文芳，韩保萍，朱启登，等．HPLC测定盐酸奥洛他定滴眼液中苯扎氯铵的含量[J]．食品与药品，2010，11（12）：425－427．

[3]朱样根，龚楚良．右旋糖酐70甘油滴眼液中苯扎氯铵含量测定方法研究[J]．药物分析，2012，32（3）：461－463．

Determination of Benzalkonium Chloride in Loteprednol and Tobramycin Ophthalmic Suspension by HPLC

Yang Longhua，Su Jie，Chen Tao，Lu Jingguang
（Qingdao Institute for Food and Drug Control，Qingdao，Shandong，China 266071）

Objective To establish an HPLC method for the determination of benzalkonium chloride in Loteprednol and Tobramycin Ophthalmic Suspension．Methods After being filtrated，samples were separated by HPLC on a Waters Spherisorb S5 CN column（250 mm× 4．6 mm，5 μm）．The mobile phase was 0．1% phosphoric acid water solution－ acetonitrile－ tetrahydrofuran（52∶39∶15）．The detection wavelength was 216 nm．The flowing speed was 1．5 mL／min．The column temperature was 30℃．Results The mass concentration of benzalkonium chloride was in good linear relationship with the peak area in the range of 0．04－0．20 g／L（r＝0．999 9，n＝5），and the average recovery rate was 100．22%，RSD＝0．59%(n＝9）．Conclusion The method is sensitive，accurate and convenient with good resolution，it can be applied to control the quality of Loteprednol and Tobramycin Ophthalmic Suspension．

HPLC；benzalkonium chloride；Loteprednol and Tobramycin Ophthalmic Suspension；antiseptic;content determination

R927．2；R988．1

A

1006－4931(2016)02－0070－03

杨龙华（1979－），女，硕士研究生，主管药师，研究方向为药物质量分析方法，（电子信箱）ylh＿qd＠126．com。

2015－07－05)