‘东方晨曲’铁线莲小孢子发生和雄配子体发育进程的解剖学研究

张敏涛，张 荻，申晓辉

(上海交通大学 农业与生物学院，上海 200240)

‘东方晨曲’铁线莲小孢子发生和雄配子体发育进程的解剖学研究

张敏涛，张 荻，申晓辉*

(上海交通大学 农业与生物学院，上海 200240)

以晚花铁线莲类的‘东方晨曲’为实验材料，利用常规石蜡切片技术对其小孢子发生和雄配子体发育进行观察，以探究其胚胎发育特征。结果显示：(1)‘东方晨曲’成熟花朵的雄蕊120～160枚，花药4室。(2)花药壁从外至内依次由表皮、药室内壁、中层和绒毡层组成，花药壁的发育方式是双子叶型。(3)花粉母细胞减数分裂过程中的胞质分裂为同时型，四分体中小孢子排列大部分呈四面体型，少数呈左右对称型。(4)成熟花粉是2-细胞花粉型，具3个萌发沟，扫描电镜下观察成熟花粉粒是圆球形，外壁呈光滑状或波浪状。研究发现，‘东方晨曲’铁线莲小孢子发生和雄配子体发育没有发生异常现象，可作为培育高观赏价值铁线莲杂交种的父本品种。

铁线莲；小孢子；雄配子体

铁线莲属(ClematisL.)隶属于毛茛科(Ranunculaceae)，全世界约有300余种原生种，3 000多种园艺品种，中国约有133种。铁线莲为常绿或落叶攀援灌木，罕直立灌木或宿根草本。中国各地都有分布，尤以西南和华中地区种类较多。花型新颖别致，富于变化，花朵色泽调和，花期较长，有“藤本皇后”之美誉[1]，在垂直绿化中具有极其重要的作用。依据铁线莲不同群组的种植特点和养护需求，将铁线莲分为三大类，包括早花铁线莲类；大花铁线莲类；晚花铁线莲类[2]。其中，早花类为主花期在冬末初春的小花铁线莲，晚花类为主花期在春末夏初的小花铁线莲，大花类为主花期在春夏的大花铁线莲。

长期以来许多学者对铁线莲属的种质资源、系统分类、栽培繁殖等做过大量的研究[3]，但有关铁线莲属植物胚胎发育研究的报道很少涉及。铁线莲属植物胚胎发育研究不仅可以探究本属植物亲缘演化关系，而且为本属植物杂交育种、新品种选育、园林应用提供理论基础。全雪丽等[4]采用石蜡切片技术对棉团铁线莲(Clematishexapetala)的小孢子发生和雄配子体发育过程进行观察研究，而其他种类铁线莲鲜有报道。上海作为“国家园林城市”，长期以来致力于引种各类具有高观赏价值、较强适应性的园林植物，被誉为“藤本皇后”的铁线莲是重要的引种对象。

根据铁线莲分类，我们引种了三大类铁线莲中的30余种铁线莲，包括早花铁线莲类：‘华沙女神’(‘Warszawska Nike’)、‘爱莎’(‘Asao’)等；晚花铁线莲类：‘东方晨曲’(‘Ernest Markham’)、‘如梦’(‘Hagley Hybrid’)等；大花铁线莲类：‘总统’(‘The President’)、‘繁星’(‘Nelly Moser’)等。经过2年的培育筛选发现，‘东方晨曲’，‘华沙女神’，‘如梦’等品种较为适应上海地区夏季高温干旱的气候，而‘东方晨曲’最具代表性。‘东方晨曲’一年有2次花期，主花期4～6月，开花时花量大，花瓣有天鹅绒般的光泽，花色艳丽，具有极高的观赏价值，且植株较少感染枯萎病。因此，本研究选择‘东方晨曲’作为实验材料，研究其小孢子发生和雄配子体发育，为探究观赏型铁线莲的胚胎学特征奠定基础，也为进一步开展铁线莲杂交育种研究做好准备。

1 材料和方法

1.1 植物材料

供试材料为种植于上海交通大学试验基地(30°55′60″ N，121°25′19″ E)的晚花组铁线莲(‘东方晨曲’)，共栽植10盆。试验基地年降雨量约1254.9 mm，全年平均气温17.5 ℃，出梅后的上海在7月最易出现极端高温，极端最高温度可达38 ℃，1月极端最低温度可达-8 ℃[5]。根据观察，‘东方晨曲’每年的发芽期大致在2月中旬，展叶期在2月末，一年2次开花，主花期自4月中下旬至6月中旬，次花期自7月中旬至8月中下旬。

1.2 实验方法

1.2.1 FAA固定法 取材时间自2015年2月16日花芽刚分化开始至2016年5月9日大部分植株花朵进入盛花期结束，连续取材2年。由于‘东方晨曲’顶芽先发育侧芽后发育，前期取材时，主要取顶芽和第1节位叶腋处的芽[1]，后期取材时，主要取第2～3节位叶腋处的芽。每隔1 d对不同发育阶段的花芽进行取材，每次取5～10个不同大小的花蕾(图版Ⅰ，1)，立即放入FAA固定液中(福尔马林∶冰醋酸∶70%乙醇=5∶5∶90，体积比)进行固定[6]。

1.2.2 胚胎发育石蜡切片观察 经过爱氏苏木精染色液室温整体染色7～10 d后，进行自来水蓝化处理；对试材进行逐级酒精脱水，二甲苯透明，58 ℃浸蜡处理48 h后，进行石蜡包埋。利用常规石蜡切片法制片[7]，切片厚度为8～12 μm，脱蜡处理后，中性树胶封片，Olympus光学显微镜观察并拍照[8]。

1.2.3 扫描电镜观察 ‘东方晨曲’花朵开放时收集成熟花粉，放入3%戊二醛固定液中进行固定，样品经酒精梯度脱水，醋酸异戊酯置换，CO2临界点干燥，真空喷金镀膜3 min，在Sirion 200高分辨场发射扫描电子显微镜下观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 花器官形态

‘东方晨曲’的花与其他植物最主要的区别在于，它的“花”不是由花瓣组成，而是萼片瓣化，构成了花的形态[2]。‘东方晨曲’的花形为平盘形，萼片平展，边缘有略微褶皱。

‘东方晨曲’花器官由以下几部分组成：(1)最外轮花器官为花萼，在花朵开放前2～3 d萼片开裂，花萼6～7片(图版Ⅰ，2)。(2)花萼片基部合生(图版Ⅰ，3)，呈长椭圆卵形，萼片边缘生有短绒毛，萼片长约4.8～6.2 cm。在盛花期，花萼呈紫红色，萼瓣中线为红色。(3)雄蕊生于花萼内轮，雌蕊外轮(图版Ⅰ，4)。成熟花朵的雄蕊为120～160枚，着生于花萼筒基部，排列整齐。花朵成熟时，花丝长约1～1.05 cm，花药长约0.65～0.75 cm，花药边缘呈鲜黄色，中脉呈红褐色(图版Ⅰ，5)。成熟花药的开裂方式为纵裂。(4)花柱细长，连同柱头长约1.75～1.8 cm，花柱呈鲜黄色(图版Ⅰ，6)。

2.2 花药壁的发育

‘东方晨曲’的花为两性花，花药4室(图版Ⅱ，1)。花药壁由4 层结构组成，由外至内分别为表皮、药室内壁、1～2层的中层和绒毡层(图版Ⅱ，2)。‘东方晨曲’花药壁发育属于双子叶类型。花药的表皮由雄蕊原基的表皮细胞直接发育而来。在花芽分化阶段，孢原细胞在花药表皮细胞下方开始分化，孢原细胞细胞核大、细胞质浓，可以与周围细胞很明显地区分开来(图版Ⅱ，3)。孢原细胞通过平周分裂分化成2层细胞，外层是初生造壁细胞，内层是初生造孢细胞。初生造壁细胞继续通过平周分裂分化成2层次生造壁细胞，外层次生造壁细胞继续分裂成药室内壁和中层细胞(图版Ⅱ，4)，而内层的次生造壁细胞直接发育成绒毡层细胞。在花粉发育过程中，中层细胞不断受到挤压，最终完全消失。减数分裂初期，绒毡层细胞普遍为单核，细胞核较小，细胞质较浓(图版Ⅱ，5)。在四分体时期，绒毡层细胞的体积达到最大，绒毡层尚在原位[9]。在四分体时期之后，绒毡层细胞依然存在，但体积变小(图版Ⅱ，16)。

2.3 小孢子的发生

初生造孢细胞经过有丝分裂形成次生造孢细胞，次生造孢细胞直接发育成小孢子母细胞(花粉母细胞)。刚开始，小孢子母细胞排列紧密，在外形上与周围的药壁细胞有显著差异[10]，呈多边形或不规则形状(图版Ⅱ，6)，细胞核明显且染色较深，无明显液泡。之后，到了减数分裂阶段，胼胝质壁逐渐加厚，在排列方式上变得更为疏松，促使小孢子母细胞由多边形变成圆球形[11]，并含有较为明显的液泡(图版Ⅱ，7)。减数分裂经过前期Ⅰ(图版Ⅱ，8)、中期Ⅰ(图版Ⅱ，9)、后期Ⅰ(图版Ⅱ，10)进入末期Ⅰ(图版Ⅱ，11)。小孢子母细胞在减数第一次分裂中不伴随细胞壁的产生，直接进入减数第二次分裂。表明小孢子母细胞没有被分隔成两个子细胞，即没有出现二分体，因此判定‘东方晨曲’小孢子减数分裂的胞质分裂属于同时型。绒毡层细胞绝大多数是双核，甚至是三核，细胞核普遍较大(图版Ⅱ，12)。至末期Ⅱ(图版Ⅱ，13)，两个纺锤体空间位置发生变化，多呈垂直状态。最终被一层厚的胼胝质包围成四分体(图版Ⅱ，14)，四分体多呈四面体型，少数为左右对称型。

2.4 雄配子体的发育

减数分裂刚开始时，小孢子母细胞就在不断形成胼胝质壁，到减数第二次分裂阶段四分体时期最丰富，4个小孢子既被共同的胼胝质壁包围，相互之间又被胼胝质壁分离；在四分体时期之后，四分体周围的胼胝质壁逐渐解体，四分体中的小孢子继而释放到药室中，逐渐分散开形成单核小孢子，成为独立的个体。刚从四分体中释放出来的小孢子[12]，体积较小，形状呈不规则形(图版Ⅱ，15)。之后小孢子的体积逐渐增大，呈现圆形(图版Ⅱ，15)。此时小孢子的细胞核位于小孢子细胞的中心，此时期即为单核中央期(图版Ⅱ，17)，典型的花粉壁和3个萌发沟正式形成。之后，一个大液泡在细胞内形成，将细胞核推向细胞壁的一侧，此时期即为单核靠边期(图版Ⅱ，18)。随后小孢子继续发育，经过不均等有丝分裂，形成2个不均等的细胞核，拥有较大细胞核的为营养细胞；拥有较小细胞核的为生殖细胞。起初生殖细胞呈现凸透镜状(图版Ⅱ，19)，紧贴花粉壁一侧。随着花粉进一步发育，生殖细胞开始脱离花粉壁，随后生殖细胞游离在小孢子细胞的细胞质中，生殖细胞变为圆球形。‘东方晨曲’成熟花粉细胞为2-细胞花粉型(图版Ⅱ，20)。当花药开裂时，药室内壁细胞已经发生了辐射性伸长，纤维化加厚(图版Ⅱ，16)。

通过扫描电镜观察，成熟花粉粒近圆球形，直径约为15～16 μm。花粉具3个萌发沟(图版Ⅱ，21)，沟区明显，从极顶面可观察到以等间距分布的3条孔沟[13]。表面纹饰几乎全部呈颗粒状(图版Ⅱ，22)，有分布均匀的孔穴。外壁轮廓线有较光滑、波浪状(图版Ⅱ，23)和微刺状突起(图版Ⅱ，24)3种纹饰。

3 讨 论

研究发现，‘东方晨曲’花药具4个花粉囊；小孢子母细胞减数分裂的胞质分裂为同时型；四分体中小孢子排列大部分呈四面体型；药室内壁在花粉母细胞发育后期发生纤维化加厚；成熟花粉粒为2-细胞型，具3个萌发沟。这些特征符合全雪丽等[14]研究棉团铁线莲(Clematishexapetala)的胚胎学特征。‘东方晨曲’每朵花内的雄蕊发育时期是不同步的[15]，雄蕊从外轮到内轮逐渐成熟，这与棉团铁线莲的雄蕊发育特征相同，与毛茛科(Ranunculaceae)耧斗菜属(Aquilegia)植物尖萼耧斗菜(AquilegiaoxysepalaTrautv.et C.A.Mey.)的特征是正相反的[16]，尖萼耧斗菜的雄蕊是从内轮到外轮逐渐成熟。

3.1 绒毡层与小孢子母细胞的同源性

本研究对‘东方晨曲’中绒毡层和小孢子母细胞的起源问题进行了仔细研究，从绒毡层开始形成时细胞的大小、排列方式、细胞核大小等各方面与其内部的造孢细胞和外部的药室内壁和中层细胞进行了综合比较分析，最后判定绒毡层细胞是由内层的次生造壁细胞发育形成，小孢子母细胞是由次生造孢细胞发育而来，两者都是由孢原细胞分化而来。但在‘东方晨曲’中，个别次生造孢细胞没有转变为小孢子母细胞，无法进行减数分裂。与小孢子母细胞相比，其细胞核较浓，与外层的绒毡层细胞几乎一致(图版Ⅱ，25)，更进一步证明了绒毡层与花粉母细胞的同源性。

3.2 雄性发育过程中的不同步性

同一花药不同花粉囊内的分裂进程存在不一致，导致在一个横切面上可以同时观察到几个先后相关的时期，一般相差2～3个时期。一般来说，同一花粉囊内的小孢子母细胞减数分裂大部分同步[9]。同一花药不同花粉囊之间，小孢子发育可能不同步，赵桦等[17]认为这是植物对延长传粉期的适应性表现。‘东方晨曲’中，观察到同一花粉囊内减数分裂的不同步现象(图版Ⅱ，26)，主要出现在小孢子母细胞进入减数分裂的高峰期(减Ⅰ末期)。在通辽杨(PopulussimoniiCarr.×P.nigraL.‘Tong liao’)[18]小孢子母细胞减数分裂进程也观察到这种现象。本研究认为，‘东方晨曲’同一花粉囊内减数分裂的不同步现象可以增加花粉活性时间，延伸花期，有利于其种群繁殖后代。

3.3 绒毡层结构与功能

绒毡层的结构与功能一直是雄性发育过程研究的重点之一[19]。‘东方晨曲’刚形成绒毡层时，是由初分化的薄壁细胞组成。在减数分裂四分体时期，绒毡层细胞发生有丝分裂，出现二核甚至三核现象，达到发育的最高阶段[20]。完成减数分裂后，小孢子从四分体游离出来时，绒毡层细胞开始解体，本研究推测此时绒毡层开始为小孢子发育提供营养物质。在小孢子单核中央期及单核靠边期，绒毡层大部分解体(图版Ⅱ，27)，在成熟花粉粒时期，绒毡层几近消失(图版Ⅱ，28)。

通过比较发现，‘东方晨曲’和棉团铁线莲在绒毡层的类型上可能存在差异。根据观察，在‘东方晨曲’小孢子四分体时期，绒毡层尚在原位，当小孢子游离后不久，绒毡层的周缘质团流入小孢子之间(图版Ⅱ，28)，充分围绕花粉粒[9]，符合周缘质团绒毡层的特征。而棉团铁线莲的绒毡层属于腺质绒毡层，小孢子发育过程中，绒毡层始终保持在原来位置。因此，相比棉团铁线莲，‘东方晨曲’在雄性发育过程中，绒毡层提供的营养物质向药室输送的效率更高。

不同铁线莲绒毡层的解体时间是有差异的，如棉团铁线莲[4]的绒毡层在第1次减数分裂时已出现解体迹象，而‘东方晨曲’的绒毡层直至雄配子体发育阶段才开始解体。因此，两者在营养物质输送的时间上存在差别，棉团铁线莲绒毡层承担的小孢子营养功能主要在小孢子发育的早期，而‘东方晨曲’绒毡层在小孢子发育的后期开始提供营养。

本研究从花器官的外部形态，花药内部显微结构等方面系统、全面地对‘东方晨曲’铁线莲小孢子发生与雄配子体发育过程进行了分析[21]，探明了‘东方晨曲’铁线莲的雄性发育过程，为进一步深入研究‘东方晨曲’铁线莲甚至观赏型铁线莲植物发育过程中的发育机制奠定了坚实基础。

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图版Ⅰ ‘东方晨曲’铁线莲花芽及花朵形态 ant．花药；thr．花丝1．由小及大采集花苞；2．紫红色花萼片，边缘有略微褶皱；3．花萼片基部合生，呈长椭圆卵形；4．雄蕊生于花萼内轮，雌蕊外轮；5．花药边缘呈鲜黄色，中脉呈红褐色；6．花柱呈鲜黄色PlateⅠ The morphology of flower bud and flower of Clematis ‘Ernest Markham’ ant. anther; thr. thrumFig.1. Collecting bud from small size to large size; Fig.2. Sepals are purple and the edge of sepals has slightly fold; Fig.3. Sepals in base is accrete and long elliptic ovate; Fig.4. Stamen grows inside of sepal and outside of pistil; Fig.5. The edge of anther is bright yellow and the midrib of anther is reddish brown; Fig.6. Style is bright yellowPlateⅡ Anatomical observation of male gametophyte development of Clematis ‘Ernest Markham’ and pollen morphology under SEMasc. archesporial cell; end. endothecium; epi. epidermis; il. inner secondary parietal layer; ml. middle layer; ol. outer secondary parietal layer; tap. tapetum; mmc. microspore mother cell; proⅠ. Prophase of meiosisⅠ; metⅠ. MetaphaseⅠ; anaⅠ. AnaphaseⅠ; telⅠ. TelophaseⅠ; telⅡ. TelophaseⅡ; tet. Tetrad stage; ms. microspores; ms-cs. microspore at the cetral stage; ms-vs. microspore at the vacuolation stage; gen & veg. generative cell and vegetative cell; two-cell. ‘two-celled type’ mature pollen; fib. endothecial cells develop fibrous thickenings; sph-gen. spheroidal generative cellFig.1. The anther with four chambers; Fig.2. Structure of the anther wall; Fig.3. Archesporial cell of microspore; Fig.4. Inner secondary parietal layer dividing into the endothecium and the middle layers; Fig.5. The tapetum reaches maximal size during microspore meiosis; Fig.6. The shape of the newly formed microspore mother cell is polygonal or irregular; Fig.7. The shape of the microspore mother cell becomes circular gradually; Fig.8. Prophase of meiosisⅠ; Fig.9. MetaphaseⅠ; Fig.10. AnaphaseⅠ; Fig.11. TelophaseⅠ; Fig.12. The nucleus of the tapetum is becoming bigger, mostly a cell with one or two nuclei, seldomly a cell with three nuclei; Fig.13. TelophaseⅡ; Fig.14. Tetrad stage; Fig.15. The microspores having shedded from the tetrads are polygonal or circular; Fig.16. Transverse section of tetrasporangiate anther. endothecial cells develop fibrous thickenings when shed; Fig.17. Uninucleate microspore at the cetral stage; Fig.18. Uninucleate microspore at the vacuolation stage; generative cells are convex lens type, close to the cell wall; Fig.19. Through microspore mitosis, generative cell and vegetative cell form; Fig.20. Generative cell begins to separate from the cell wall, finally mature pollen is two-celled type; Fig.21. 3 colporates; Fig.22. The exine ornamentation of pollen grains is granular; Fig.23. The contour line of pollen exine is wavy; Fig.24. The contour line of pollen exine is smooth and partly has spina; Fig.25. After tetrad stage, the tapetum still exists; Fig.26. In the same pollen sac, microspore mother cells not only have prophase of meiosisⅠbut also the phase of telophaseⅠ; Fig.27. When the mononuclear uninucleate microspore is at the central and vacuolation stage, most of tapetum cells begin to collapse; Fig.28.In the period of pollen mature, tapetum cells disappear completely and generative cell becomes spheroidal

图版Ⅱ ‘东方晨曲’铁线莲雄性发育的石蜡切片观察和电镜下花粉形态asc．孢原细胞；end．药室内壁；epi．表皮；il．内层次生造壁细胞；ml．中层；ol．外层次生造壁细胞；tap．绒毡层；mmc．小孢子母细胞；proⅠ．前期Ⅰ；metⅠ．中期Ⅰ；anaⅠ．后期Ⅰ；telⅠ．末期Ⅰ；telⅡ．末期Ⅱ；tet．四分体；ms．小孢子；ms-cs．中央期小孢子；ms-vs．靠边期小孢子；gen & veg．营养细胞和生殖细胞；two-cell．2-细胞花粉型；fib．药室内壁细胞发生辐射性伸长；sph-gen．圆球形生殖细胞1．4室花药；2．花药壁结构；3．孢原细胞；4．内层次生造壁细胞发育成药室内壁与中层细胞；5．小孢子减数分裂时绒毡层细胞达到最大；6．刚形成的小孢子母细胞呈多边形或不规则形；7．小孢子母细胞逐渐呈圆球形；8．减数分裂前期Ⅰ；9．中期Ⅰ；10．后期Ⅰ；11．末期Ⅰ；12．绒毡层细胞细胞核大，多为单核或双核；13．末期Ⅱ；14．小孢子四分体时期；15．刚从四分体中释放出来变形的小孢子，多边形或圆形；16．花药横切面。花药开裂时，药室内壁细胞已经发生了辐射性伸长，纤维化加厚；17．单核中央期的小孢子；18．单核靠边期的小孢子，生殖细胞呈凸透镜形，紧贴细胞壁；19．小孢子经过有丝分裂，形成生殖细胞和营养细胞；20．生殖细胞开始与细胞壁分离，成熟小孢子为2-细胞花粉粒；21．3个萌发沟；22．表面纹饰呈颗粒状；23．外壁轮廓线呈波浪状；24．外壁轮廓线呈光滑状，少部分呈微刺状突起；25．小孢子四分体时期之后，绒毡层细胞依然存在；26．同一花粉囊内小孢子母细胞既有前期Ⅰ，也有末期Ⅰ；27．在小孢子单核中央期及单核靠边期，绒毡层大部分解体；28．在成熟花粉粒时期，绒毡层完全消失，生殖细胞变圆球形

(编辑:潘新社)

Anatomic Study of Microsporogenesis and Male Gametophyte Development ofClematis‘Ernest Markham’

ZHANG Mintao, ZHANG Di, SHEN Xiaohui*

(School of Agrilculture and Biology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China)

In this study,Clematis‘Ernest Markham’ which belongs to Late-floweringClematiswas chosen as the experimental material. The procedures of microsporogenesis and male gametophyte formation ofClematis‘Ernest Markham’ were observed by traditional paraffin section technique, and we planned to explore its characteristics of embryonic development. The results were as follows: (1) each floret of inflorescence usually had dozens of fertile stamens, and the anther has four chambers. (2) The structure of anther wall was the monocotyledonous type, which was composed of epidermis, endothecium, middle layer and tapetum. (3) The cytokinesis of microspore mother cell meiosis was simultaneous type, and most of the tetrads were isobilateral, occasionally tetrahedral. (4) The mature pollen grains were the bicellular type with three grooves. With scanning electronic microscope, the mature pollen grains which appeared spherical in shape were observed, and the exine was almost smooth or wavy. These results suggested that microsporogenesis and male gametophyte development ofClematis‘Ernest Markham’ were normal, which could be used as the male parental variety cultivatingClematishybrid with high ornamental value and provided the basis for the further research about the embryological features of ornamentalClematisplants.

Clematis; microspore; male gametophyte

1000-4025(2016)11-2213-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.11.2213

2016-08-09;修改稿收到日期:2016-11-07

上海市科委科技攻关项目(13391901000)

张敏涛(1991-)，男，在读硕士研究生，主要从事植物胚胎学研究。E-mail：zhangmt@sjtu.edu.cn

*通信作者:申晓辉，博士，教授，主要从事植物超低温保存研究。E-mail：shenxh62@sjtu.edu.cn

Q944.58

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