高效液相色谱-串联质谱测定水产品中MS-222残留

2016-12-30黎智广杨宏亮王旭峰陈培基柯常亮李刘冬黄珂

中国渔业质量与标准 2016年1期

黎智广,杨宏亮，王旭峰，陈培基，柯常亮，李刘冬，黄珂

(中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心(广州)，农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(广州)/农业部水产品加工重点实验室，广东，广州510300)

黎智广,杨宏亮，王旭峰，陈培基，柯常亮，李刘冬，黄珂*

建立了测定水产品中MS-222残留的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)分析方法。样品经甲醇和乙腈的混合液提取，再经二氯甲烷萃取后氮气吹干，用流动相溶解，经高效液相色谱分离，以串联质谱在多反应监测模式(MRM)下进行定性与定量分析。结果表明，在1.00、10.00和50.00 μg/kg添加水平下，回收率81.2%～99.5%，相对标准偏差为2.14%～4.83%(n=6)。本方法对MS-222的定量限为1.0 μg/kg。该方法前处理过程简便，容易操作，灵敏度和重现性良好，结果准确。[中国渔业质量与标准，2016,6(1):53-57]

高效液相色谱-串联质谱；水产品；MS-222;残留；优化

随着生活水平的不断提高，鲜活水产品的需求越来越大。为了提高鲜活水产品在运输过程中的存活率，渔用麻醉剂的使用越来越广泛。目前渔用麻醉剂多达十多种，间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS-222)是使用最普遍的一种，其为白色结晶或粉末，易溶于水，水溶液透明无色，呈微酸性、耐高温。MS-222是美国 FDA 批准唯一可用于食用鱼的麻醉剂[1-2]，已经广泛用于鱼类的活体运输、标志放流。MS-222的大量使用可能导致其在水产品中产生残留，给水产品的食用安全性带来潜在的风险。为了保证水产品的食用安全性，国际上对MS-222在水产品中的使用进行了严格规定。如美国FDA规定经MS-222麻醉的食用鱼必须经21 d休药期才可在市场上销售，加拿大规定的休药期为5 d[3-4]。

目前国内外报道的有关MS- 222的检测方法主要有比色法[5]、气相色谱法[6]、液相色谱法[7-9]和液相色谱串联质谱法[10]等。比色法的背景颜色对分析的准确度影响比较明显；而后3种检测方法的样品前处理较繁琐，需要专业的设备。综上所述，急需建立一种简便的检测方法以满足行业的需要。本研究采用高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)技术，建立了水产品鱼体中MS-222的检测方法。结果表明，本法样品处理简便快速，测定结果准确可靠。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

N-EVAP111氮吹仪(美国Organomation公司)，DL-6000B离心机(上海安亭科学仪器厂)，超声萃取仪(广州嵩瑞仪器有限公司)，旋涡混合器(上海一恒科学仪器有限公司)，Milli Q去离子水发生器(美国Millipore公司)等。间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS-222)(纯度大于98%，阿拉丁公司)。乙腈、甲酸、甲醇为色谱级(美国Sigma公司)，乙酸乙酯、无水硫酸钠等为分析纯(广州化学试剂厂)。

1.2 样品处理

准确称取2.00 g均匀的肉样于50mL 离心管中，加入15 mL乙腈+甲醇+水(50∶25∶25,V/V)所混合的提取液。旋涡后超声15 min，往离心管中接着加入10 mL二氯甲烷旋涡再用6 000 r /min离心10 min，离心后将下层二氯甲烷全部转移于10 mL 玻璃离心管中，于40 ℃水浴中氮吹至干。用1.00 mL 5 mmol乙酸铵+甲醇(1∶1,V/V)定溶。如果油脂过多或者比较混浊可转移至1.5 mL离心管中14 000 r/min离心10 min，分层后吸取澄清的定溶液过0.2 μm 微孔滤膜后，待测。

1.3色谱条件

色谱柱：Acquity BEH C18柱，50 mm×2.1 mm(id)，1.7 μm；进样量为5.0 μL，流速为0.3 mL/min。柱温为35 ℃。流动相为甲醇(A)与5 mmol/L乙酸铵(B)，采用梯度洗脱(表1)。

1.4 质谱条件

Waters UPLCXevo TQ，质谱条件离子化模式：ESI+；毛细管电压为0.5 kV；锥孔电压为30 V；脱气剂温度为500 ℃。脱溶剂气流量为700 L/Hr；锥孔气流量为50 L/Hr。

MS-222的MRM离子对及质谱检测参数具体见表2。

表1 流动相梯度洗脱表

Tab.1 Gradient elution of mobile phase

步骤Step时间/min TimeA/%B/%00257511257522851532.595543.52575552575

表2 MS-222的MRM离子对及质谱条件参数

Tab.2 MRM ion pair and MS parameters for 3-Aminobenzoic acid ethyl ester methanesulfonate

化合物Compound离子模式Ionmode离子通道Ionchannels锥孔电压Cone/V碰撞能CE/VMS-222ESI+*166.0>138.03035MS-222ESI+166.0>77.13035

注：*离子对为定量离子对。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的确定

MS- 222水溶性高，易溶于强极性有机溶剂如二氯甲烷、甲醇、乙腈、乙醇等。选用溶剂提取时，应尽可能使组织中结合态的残留物溶解，并且可除去大部分的蛋白质等杂质。本文选用乙腈、50%甲醇、50%乙腈、乙酸-乙酸钠缓冲液等几种提取试剂分别进行实验。结果表明，这几种试剂单独提取效果较差，即50%甲醇溶液的提取率仅有25%左右,而乙腈或甲醇的提取率也不过35%左右。用混合溶剂提取效果明显提高，即乙腈+甲醇+水(50∶25∶25，V/V)和乙腈+乙酸-乙酸钠缓冲液+甲醇+水(50∶25∶12.5∶12.5,V/V)两种混合溶剂的提取，其回收率分别达到81%以上和76%左右。用乙腈+乙酸-乙酸钠缓冲液+甲醇+水作为提取剂，样品的含水量影响较大，部分样品呈现乳浊液状态，分层效果不理想，从试剂配制难易及提取液分层情况考虑，本研究选择了乙腈+甲醇+水(50∶25∶25，V/V)作为提取剂。

经过实验比较，提取剂用量从5 mL至15 mL时其提取率呈快速上升趋势，用量在15 mL以后提取率则趋于平稳，所以提取液的用量定为15 mL。此外，提取过程中加入无水硫酸钠可脱去组织中的水分，有助于样品的充分提取和加快分层。

液相色谱串联质谱的专属性强，杂质干扰比较少。定容的残渣如果沉淀物或脂肪比较明显，可把定溶液转移到1.5 mL的离心管里，高速冷冻离心后过滤可直接上机检测。与进行固相萃取操作相比，本方法操作步骤中的净化过程较简单快速，处理样品时间短且成本较低，便于大批量的样品快速检测分析。

2.2 质谱条件的选择

在ESI正离子模式下，全扫描MS-222标准物质谱图得到离子峰[M+H]+。将浓度为1.0 mg/L 的MS-222标准溶液进入一级质谱扫描后确定其分子离子为m/z 166.1。以其作为母离子进行二级质谱扫描，选择信号相对较强的两个特征离子峰，与其对应的母离子组成多反应监测(MRM)离子对。然后在多反应监测模式下优化各项质谱参数，提高其响应值。质谱参数具体见表2。

2.3 高效液相条件的优化

选用乙酸铵缓冲液和甲酸等水相溶液为流动相，有机相选择甲醇与乙腈及酸化乙腈来实验比较，用梯度洗脱优化10.0 ng/mL的标准溶液。经过实验比较后，乙酸铵混合甲酸溶液与酸化乙腈的梯度所得灵敏度高、峰形相对较好，基线低，信噪比等都达到要求。在实验过程中有机相所占比例较大时出峰快，峰形也较好，但本提取实验研究发现，杂质峰与较高的基线影响了目标峰，不符合检测要求。流动相的梯度经过调整后推迟了目标峰的出峰时间，使大部分杂质先洗脱出色谱柱，目标峰在2～2.5min这个区间洗出，目标峰分离良好，且峰形尖锐、对称。经多次实验表明，在这个时间区间内色谱图中基本上没有出现杂质峰，可以达到检测要求。参数具体见图1。

图1 草鱼中MS-22离子对色谱图(加标量1.0 μg·kg-1)Fig.1 Chromatogram of MS-222 ion pair in Ctenopharyngodon idellus (plus scalar 1.0 μg·kg-1)

2.4 方法的准确度，精密度及线性范围

在2.00 g空白样品中添加浓度为20.00、200.00和1 000.00 μg/L的标准液0.100 mL，分别制得为1.00、10.00和50.00 μg/kg，每个水平做6个平行样品。加标后漩涡混匀，静置30 min，按1.2所述方法处理样品，然后按确定的检测方法测定。结果表明在此水平上，3种水产样品的回收率为81.2%～99.5%，相对标准偏差为2.14%～4.83%(表3)。以3倍信噪比计算，检测限为0.5 μg/kg，定量限为1.0 μg/kg(S/N≥10)。在1.00～10.00 μg/L浓度范围内线性良好，相关系数为0.999 7(图2)。

表3 不同浓度的样品回收率和精密度

Tab.3 Recovery rate and precision of different concentrations of samples

样品Sample添加量/(μg·kg-1)Additiweamount实测值1/(μg·kg-1)Meas-uredval-ue1实测值2/(μg·kg-1)Measuredvalue2实测值3/(μg·kg-1)Measuredvalue3实测值4/(μg·kg-1)Measuredvalue4实测值5/(μg·kg-1)Measuredvalue5实测值6/(μg·kg-1)Measuredvalue6测得量平均值/(μg·kg-1)Mean回收率平均值/%AveragerecoveryrateRSD/%罗非鱼1.000.870.890.960.890.920.880.9090.13.3410.009.529.219.089.619.959.339.4594.53.3150.0049.5048.6047.6049.1047.8048.2048.3096.62.14草鱼1.000.840.830.860.890.920.840.8686.34.2810.009.569.719.829.639.939.239.6596.52.5250.0048.0746.8043.9048.1048.8049.1047.6095.14.15鳗鲡1.000.830.830.860.810.920.840.8584.84.5610.009.369.579.529.739.658.999.4794.72.8150.049.7048.6045.6045.1046.8043.7046.6093.24.83

图2 曲线方程与相关系数Fig.2 The equation of a curve and correlation coefficient

3 结论

本研究建立的高效液相色谱串联质谱测定水产品中MS-222的方法，经过加标回收等实验证明，前处理过程简便快捷、容易操作，方法灵敏度高，重现性好，适合水产品中MS-222的检测要求。在实际操作中，本方法可以在评估环境对鱼的活力及健康养殖影响提供依据[11-14]，同时亦可以在该药物销售及使用过程中监控其休药期情况。

[1] 张丽,汪之和.MS-222对大黄鱼成鱼麻醉效果的研究[J].科技与产业,2010,8(5):38-40.

[2] Sink T D,Strange R J,Sawyer R E.Clove oil used at lower concentrations is lesseffective than MS-222 at reducing cortisol stresss responsesin anestheticzed rainbowtrout[J]. N Am J Fish Manage,2007, 27:156-161

[3] Burka J F,Hammell K L, Horsberg T E, et al. Drugs in salmonid aquaculture : a review[J]. J Vet Pharmacol Ther, 1997, 20(5): 333-349.

[4] Scherpenisse P,Bergwerff A A.Determination of residues of tricaine in fish using liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Anal Chim Acta, 2007(586):407-410.

[5] 樊梅芳,薛秀鸿,钱红美,等.鱼中三卡因残留量的比色测定法[J].中国药科大学学报,1996,27(3):191-192.

[6] Sills B, Luhning CW.Gas-liquid chromatogramphic determineation of residues of methanesulfonate of naminobenzoic acid ethyl ester in fish[J].J Assoc Off Anal Chem,1977,60(4):961-2.

[7] 任洁,韩育章,何静,等.鱼体组织中MS-222的高效液相色谱分析方法[J].水利渔业, 2000,20(5):6-8.

[8] De V.Molina L,Vilar A,et al.Effects of different anaesthetics in the transport of the sardineSardina pilchardus[J].Boletin del Instituto Espanol de Oceanografia,2005,21(4):477-480.

[9] 崔冶建，付亚平，施群.反相高效液相色谱法测定鱼脑中MS-222的浓度[J].中南民族学院学报(自然科学版),1996,3(15):65.

[10] 朱敏,孙伟红,邢丽红,等.液相色谱-串联质谱法测定水产品中麻醉剂MS-222[J].分析实验室,2012,31(6):59-62.

[11] 方静,黄卉,李来好.不同致死方式对罗非鱼鱼片品质的影响[J].南方水产科学,2013,9(5):13-18.

[12] 赵永强, 李来好, 杨贤庆. 臭氧在水产品加工中应用综述[J].南方水产科学,2013,9 (5): 149-154.

[13] 惠芸华, 蔡友琼, 于慧娟.镇静类药物在活鱼运输中的应用研究进展[J].中国渔业质量与标准, 2014,4(2):39-43.

[14] 吕海燕, 王群, 刘欢 .鱼用麻醉剂安全性研究进展[J]. 中国渔业质量与标准，2013,3(2):24-28.

High performance liquid chromatography - tandem mass spectrometrydetermination of MS - 222 residues in aquatic products

LI Zhiguang, YANG Hongliang, WANG Xufeng, CHEN Peiji, KE Changliang, LI Liudong, HUANG Ke*

(Ministry of Agriculture Supervision and Testing Center for Fishery Environment and Aquatic Products (Guangzhou);South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences;Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Aquatic Product on Storage and Preservation(Guangzhou),Ministry of Agriculture/Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry ofAgriculture, Guangzhou 510300, China)

We established analysis method for the determination of MS-222 residues in aquatic products by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) analysis method. The samples were extracted by mixture of methanol and acetonitrile, followed by dichloromethane for drying with nitrogen, and was then dissolved in mobile phase. Through separation by the high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry, qualitative and quantitative analysis was conducted under multiple reaction monitoring modes (MRM). The results showed that the recovery rate was 81.2%-99.5% in 1.00, 10.00 and 50.00 μg/kg concentrations, and the relative standard deviation was 2.14%-4.83% (n=6). The limit of quantification was 1 μg/kg. The method of pretreatment process was simple, easy to operate, with sound sensitivity and reproducibility, and the results were accurate.[Chinese Fishery Quality and Standards, 2016, 6(1):53-57]Key words:HPLC-MS/MS;aquatic products; MS-222; residue; determination; optimizationCorresponding author:HUANG Ke, xiamike@163.com

2015-06-04；接收日期：2015-09-12

国家水产品质量安全风险评估项目(GJFP2014009，GTFP201501003，GJFP201501004);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2014TS10)

黎智广(1983-)，男，研究实习员，研究方向为水产品安全与质量控制，lizhiguang125@163.com 通信作者：黄珂，副研究员，研究方向为水产品质量安全研究及检测技术，xiamike@163.com

S948

2095-1833(2016)01-0053-05