诺氟沙星在日本鳗鲡体内的代谢动力学及残留消除规律

范红照，林茂，*，鄢庆枇，湛嘉，李忠琴

(1. 集美大学水产学院，福建 厦门 361021；2. 鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，福建 厦门361021；3. 宁波出入境检验检疫局，浙江 宁波 315010)

诺氟沙星在日本鳗鲡体内的代谢动力学及残留消除规律

范红照1，林茂1，2*，鄢庆枇1，湛嘉3，李忠琴2

(1. 集美大学水产学院，福建 厦门 361021；2. 鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，福建 厦门361021；3. 宁波出入境检验检疫局，浙江 宁波 315010)

为研究诺氟沙星(NFX)在鳗鲡体内的代谢和消除规律，以超高效液相色谱-串联质谱法测定日本鳗鲡在混饲口灌后血液和组织中NFX的含量变化，并进行药动学分析。结果表明，NFX以30 mg/kg的剂量单次混饲口灌日本鳗鲡后，吸收分布迅速，达峰时间(Tmax)、吸收(T1/2Ka)和分布半衰期(T1/2α)分别为3.000、1.012和1.570 h；NFX在鳗鲡体内消除较快，消除半衰期(T1/2β)为15.267 h，总清除率(CL)为1.315 L/(h·kg)。此外，峰浓度(Cmax)为1.273 mg/L，药时曲线下面积(AUC(0～∞))为22.670 mg/(L·h)。NFX以30 mg/kg的剂量连续3 d混饲口灌日本鳗鲡后，在肌肉、肝脏、肾脏和血浆中的消除速率常数分别为0.144、0.125、0.102和0.093 1/d。根据WT1.4计算的理论休药期(WDT)分别为肌肉22.97 d，肝脏21.30 d，肾脏33.40 d，血浆18.29 d。本研究结果为诺氟沙星在水产动物中的实际应用提供理论依据。[中国渔业质量与标准, 2016, 6(1):22-28]

诺氟沙星；日本鳗鲡；药代动力学；残留；消除规律

诺氟沙星(norfloxacin，NFX)属于第三代喹诺酮类药物，该药对大多数革兰氏阴性菌、部分革兰氏阳性菌及某些支原体、立克次氏体均有杀菌效果，同时在体内作用迅速、分布广泛且与其他抗生素之间无交叉耐药性，因此应用广泛[1]。农业部1435号公告第一批《兽药试行标准转正标准目录》中水产用的诺氟沙星制剂有诺氟沙星粉、乳酸诺氟沙星可溶性粉、烟酸诺氟沙星预混剂、诺氟沙星盐酸小檗碱预混剂等4种，这些列入国家标准的诺氟沙星制剂在水产动物细菌性疾病防治中发挥了重要的作用。目前已有诺氟沙星在欧洲鳗鲡(Anguillaanguilla)[2]、奥尼罗非鱼(Oreochromisaureus×O.niloticus)[3]、大黄鱼(Larimichthyscrocea)[4]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[5]、鲤(Cyprinuscarpio)[6]、鲫(Carassiusauratus)[7]、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)[8]、南美白对虾(Penaeusvannamei)[9]、菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[10]等10余种鱼虾贝类的药动学或残留消除规律的研究报道，获得了诺氟沙星在这些动物体内的药动学参数和理论休药期。在这些研究中，国内学者对于诺氟沙星休药期的获得通常根据一级消除指数方程计算，但国外的报道更趋向于使用美国FDA规定的回归法进行分析[11]。

日本鳗鲡(Anguillajaponica)是中国重要的优势养殖品种和主要的出口创汇水产品，联合国粮食及农业组织(FAO)渔业水产养殖部的统计数据[12]表明，2013年日本鳗鲡的全球养殖产量23.2万t，而中国的产量为20.8万t，占全球产量的89.7%。诺氟沙星具有较好的抗菌活性，但其在日本鳗鲡疾病防治中的应用还需要更多药理学实验数据的支持。因此，本研究模拟实际养殖条件，采用混饲口灌给药方式，研究诺氟沙星在日本鳗鲡体内的药动学和残留消除规律，并提出给药方案和休药期建议，以期为该类药物的安全使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验用鱼

日本鳗鲡购于厦门同安鳗鱼养殖场，体重为(518±66)g，实验前日本鳗鲡在生态室循环水养殖系统中暂养一周，水温(28±0.5)℃，pH(7.04±0.28)。随机抽取5尾进行色谱分析，确认无NFX残留。

1.2 仪器和试剂

超高效液相色谱-串联质谱联用仪(UPLC-MS/MS，色谱柱为T3 C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm))及其配套MassLynx Version 4.0工作站。

诺氟沙星标准对照品(≥99.6%)，购自中国药品生物制品检定所；诺氟沙星粉(规格为100 g∶10 g)为北京渔经公司产品，检测含量符合兽药质量标准；鳗鲡饲料购自天马饲料集团，检测无NFX成分。

1.3 给药和取样

选用诺氟沙星粉，给药剂量为300 mg/kg(相当于诺氟沙星 30 mg/kg)。药代动力学研究采用单次混饲口灌给药，在给药后分别于0.25、0.5、1、2、3、4、6、9、15、24、36和48 h取样；药物残留消除研究采用连续3 d混饲口灌给药，每天1次，分别在给药后1、2、3、5、8、12、20和30 d取样。每个时间点都取样5尾。血液采集后于0.1 mg/L肝素钠润洗风干的离心管中，振荡混匀后，5 000 r/min离心10 min，取上层血浆置-80 ℃保存。肌肉、肝脏和肾脏样品置于封口袋中，-80 ℃冻存。另外取未给药的鳗鲡的各组织作为空白样品。

1.4 前处理方法

吸取0.2 mL血浆(肌肉、肝和肾等组织称取0.2 g，匀浆成糊状)到试管中，加入2 mL 含0.1%甲酸的50%ACN，振荡30 s，超声波5 min，10 000 r/min离心5 min；用2 mL 100% ACN二次提取沉淀中的NFX；合并两次提取得到的上清液，并加入2 mL正己烷，析出脂类；吸取前处理液250 μL，混合750 μL 20%的DMSO，用一次性针头滤器(尼龙)过滤到进样瓶中。

1.5 检测方法及条件

样品中的药物浓度采用UPLC-MS/MS测定，流动相A2为含0.1%甲酸的水；流动相B2为含0.1%甲酸的甲醇。参数设置如下：色谱柱温度为40 ℃；进样量为10 μL；去溶剂气温度为450 ℃；去溶剂流速为800 L/h；锥孔流速为50 L/h；碰撞气体为氩气3.2×10-3mba；采用流动相梯度洗脱方式分离NFX。测定标准品时，以负离子模式在m/z50～400范围内进行一级质谱图和子离子扫描，确定NFX的离子碎片为m/z320.4的母离子和m/z分别为 302.2、276.3、233.2和205.1四种子离子，选择响应值最高的m/z302.2和m/z276.3的作为检测离子。

1.6 分析方法验证

1)制备标准曲线

在空白血浆或组织中加入NFX，使其质量浓度分别为0、0.02、0.2、0.8、2和4 μg/mL(或μg/g)，每个质量浓度设置3组平行，混匀振荡2 min后，按方法1.4处理，得各质量浓度的响应值，在Mass Lynx Version 4.0 中建立标准曲线，并确定相关系数。以3倍信噪比(S/N)计算最低检测限。

2)测定精密度

在空白血浆或组织中加入NFX，使其质量浓度分别为0.02、0.2和2.0 μg/mL(或μg/g)，混匀振荡2 min后，按方法1.4处理，记录测定得到的响应值。此过程每隔2 h进行一次，共6次。用Excel计算出各质量浓度对应的响应值的日内平均变异系数(CV)。同上述方法比较日间隔6次/周所测定的3种浓度对应的响应值，得到日间平均变异系数(CV)。

3)相对回收率

上述加标样品的响应值代入标准曲线公式计算，得到实测浓度。相对回收率=实测浓度/理论浓度×100%。

1.7 数学模型拟合与休药期的确定

药动学和残留消除的药时数据分别采用DAS 2.0和SPSS 16.0软件进行拟合[13-14]。理论休药期的分析依据美国FDA规定的回归法[11]，采用休药期计算软件WT 1.4，以对数线性回归曲线95%置信区间的上限降至药物最高残留限量(MRL)所需要的时间作为休药期[15]。中国农业行业标准规定诺氟沙星在鱼体中的MRL是50 μg/kg[16]，本研究的休药期据此标准计算。

2 结果与分析

2.1 质谱特征

诺氟沙星的子离子中，以m/z302.2响应值最高，保留时间为3.17 min(图1)。

2.2 分析方法验证

鳗鲡血浆中0.02、0.2和2.0 μg/mL等3个质量浓度水平的NFX的日内变异系数为(4.01±0.13)% ～(6.51±1.45)%，日间变异系数为(4.13±1.27)% ～(6.52±1.84)%。实验样品以当日绘制的标准曲线计算浓度，每次所绘标准曲线只有细微差别，但相关系数(R2)均大于0.998。在0.02～4 μg/mL范围内NFX质量浓度与峰面积呈线性相关，相关系数良好，最低检测限为2.5 ng/mL。相对回收率为(95.76±8.24)% ～(119.10±2.12)%。

图1 诺氟沙星标准品及样品的质谱图a: 标准品，10 ng·mL-1；b: 空白样；c: 空白样中添加标准品，10 ng·mL-1；d: 给药4 h后的样品。Fig.1 The LC-MS chromatogram of NFX standard and samplesa: Standard, 10 ng·mL-1; b: Blank; c: Standard in blank, 10 ng·mL-1; d: Plasma sample at 4 h.

2.3 药动学曲线与参数

NFX以30 mg/kg的剂量单次混饲口灌日本鳗鲡，0.25 h后血浆中药物的质量浓度为0.063 μg/mL，随后呈快速上升趋势，于3 h时达峰浓度(Cmax)1.273 μg/mL，之后持续下降，至48 h时NFX质量浓度为0.105 μg/mL，为峰浓度的8.2%(图2)。此药时曲线经DAS软件拟合分析，表明诺氟沙星口灌给药后在日本鳗鲡体内的代谢符合一级吸收，二室模型，药时曲线方程为Ct= 5.226×e-0.441t+0.79×e-0.036t- 7.762×e-0.685t，拟合度(R2)为0.935。药动学房室参数(表1)显示，口服给药后NFX在日本鳗鲡体内吸收、分布和消除均较快，其吸收(T1/2Ka)、分布(T1/2α)和消除(T1/2β)半衰期分别为1.012、1.570 和15.267 h。

2.4 药物残留消除曲线

在(28±0.5)℃水温下，分析NFX以30 mg/kg的剂量连续混饲口灌日本鳗鲡3 d后的消除情况(图3)。第1～5天在肌肉和肾中含量较高且相近，但肌肉中含量下降最快，由第1天的1.14 μg/g下降至第5天的0.19 μg/g，而肾中含量由1.10 μg/g下降至0.36 μg/g。肝内含量由第1天的0.58 μg/g降至第5天的0.046 μg/g，已经位于MRL以下。血浆中浓度与其他组织比较一直为最低。第5天后各组织血药浓度下降趋于平缓。根据消除曲线方程(表2)可知，NFX在肌肉、肝脏、肾脏和血浆中的消除速率常数分别为0.144、0.125、0.102和0.093 1/d。

图2 诺氟沙星(30 mg·kg-1)在日本鳗鲡血浆中的药时曲线Fig.2 The concentration-time curve of NFX in Anguilla japonica after single oraladministration at the dose of 30 mg·kg-1

表1 日本鳗鲡单剂量口灌诺氟沙星(30 mg·kg-1)的药代动力学参数

Tab.1 Pharmacokinetics parameters following single oral adiministration of 30 mg·kg-1of NFX toAnguillajaponica

房室参数Compartmentparameter单位Unit参数值Value非房室参数Noncompartmentparameter单位Unit参数值Value曲线下面积AUC(0～t)Mg·(L·h)-119.533曲线下面积AUC(0～t)Mg·(L·h)-119.776曲线下面积AUC(0～∞)Mg·(L·h)-122.670曲线下面积AUC(0～∞)Mg·(L·h)-122.815表观分布容积V1/FL·kg-111.441表观分布容积Vz/FL·kg-128.968清除率CL/FL·(h·kg)-11.323清除率CLZ/FL·(h·kg)-11.315吸收相半衰期T1/2Kah1.012平均驻留时间MRT(0～t)h16.680分布相半衰期T1/2αh1.570平均驻留时间MRT(0～∞)h23.786消除相半衰期T1/2βh19.389消除半衰期T1/2h15.267吸收速率常数Kah-10.685达峰时间Tmaxh3.000中央室消除速率常数K10h-10.116峰浓度Cmaxmg·L-11.273

表2 诺氟沙星在日本鳗鲡各组织中的消除曲线方程和参数

Tab. 2 Elimination curve equations and parameters inAnguillajaponica

组织Tissue残留消除方程Eliminateequation相关系数(R2)Correlation消除半衰期/d T1/2Eliminationhalflife肌肉C=0.730×e-0.144t0.9304.813肝C=0.230×e-0.125t0.9255.544肾C=0.821×e-0.102t0.9576.794血浆C=0.085×e-0.093t0.9187.452

图3 日本鳗鲡连续3 d混饲口灌诺氟沙星(30 mg﹒kg-1)后的残留消除曲线Fig.3 Elimination curve of NFX in Anguilla japonica after 3 d oral dosing (30 mg·kg-1)

2.5 理论休药期

理论休药期釆用回归计算方法分析(图4)，结果表明，(28±0.5)℃水温条件下，诺氟沙星以30 mg/kg的给药剂量连续3 d混饲口灌日本鳗鲡后，在各组织中的理论休药期分别是：肌肉为26.34 d，肝脏为24.32 d，肾脏为 35.13 d，血浆为20.72 d(MRL=50 μg/kg)。

3 讨论

3.1 诺氟沙星在鳗鲡体内的药动学特征

口灌给药方式下，诺氟沙星在日本鳗鲡体内的吸收、分布和消除较快。NFX在日本鳗鲡体内的T1/2Ka为1.012 h，吸收速率快于奥尼罗非鱼(1.97 h)[3]，但慢于鲤(0.15 h)[6]和大黄鱼(0.70 h)[4]。NFX在日本鳗鲡体内的T1/2α为1.570 h，分布速率快于奥尼罗非鱼(1.97 h)[3]、大黄鱼(2.09 h)[4]、鲤(3.41 h)[6]和鲫(1.61 h)[7]，但慢于草鱼(0.51 h)[8]。CL是反映药物从体内消除速率的重要参数[17-18]。NFX在奥尼罗非鱼[3]、鲫[7]和草鱼[8]体内的CL分别为0.55、0.57和1.08 L/(h·kg)，而在日本鳗鲡体内的CL为1.315 L/(h·kg)，相对而言消除更快。

图4 诺氟沙星在鳗鲡各组织中的理论休药期a:拟合回归线；b:95%置信区间的上限。Fig.4 Plot of the withdrawal time calculation for NFX in Anguilla japonicaa:Linear regression line; b:Tolerance limit with 95% confidence.

诺氟沙星在日本鳗鲡体内能达到较高的峰浓度(1.273 μg/mL)，持续时间长，理论上对于大部分细菌性疾病的治疗有好的效果。王晓洁等[19]测得NFX对鳗鲡细菌性病原嗜水气单胞菌(Aeromonas.hydrophila)的最低抑菌浓度(MIC)为0.16 μg/mL，刘艳辉等[20]测得NFX对淡水养殖鱼类常见的致病菌苏伯利产气单胞菌(A.sobria)、点状产气单胞菌(A.punctata)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)和肠型点状气单胞菌(A.intertinalis)的MIC分别为0.02、0.039、0.039和0.313 μg/mL。氟喹诺酮类对水产动物病原菌的MIC普遍较低[1]，在临床应用时的给药剂量取决于该剂量下的Cmax/MIC能否达到10[21]。本研究中日本鳗鲡给药2 h时NFX血药浓度升到0.85 μg/mL，到15 h时血药浓度才降为0.335 μg/mL，期间血药浓度均大于各菌MIC，Cmax/MIC界于4.07～63.65之间，说明30 mg/kg的给药剂量可在鳗鲡体内对常见致病菌产生一定范围的治疗窗。结合半衰期T1/2为15.267 h，建议其混饲口灌给药一天两次。

3.2 诺氟沙星残留在鳗鲡体内消除规律和建议休药期

残留的消除半衰期(T1/2)反映了药物在动物体内的消除速度。(28±0.5)℃水温条件下，诺氟沙星多剂量给药后在日本鳗鲡肌肉、肝、肾和血浆中的T1/2分别为4.813、5.544、6.794和7.452 d(表2)，消除较快。对于国内市场，行业标准规定诺氟沙星在鱼体中的MRL为50 μg/kg[9]，以此计算，(28±0.5)℃水温条件下，若考虑肌肉为主要食用组织，建议休药期为27 d；若考虑所有组织，则以消除最慢的肾脏为靶组织，建议把休药期延长为36 d。

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Norfloxacin pharmacokinetics and the residue elimination in Anguilla japonica

FAN Hongzhao1, LIN Mao1，2*, YAN Qinpi1, ZHAN Jia3, LI Zhongqin2

(1.Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. Engineering Research Center of the Modern Technology forEel Industry, Ministry of Education, Xiamen 361021, China; 3. Ningbo Entry-Exit Inspection and QuarantineBureau, Ningbo 315010, China)

To investigate the pharmacokinetics of Norfloxacin (NFX) in eel (Anguillajaponica), the concentration-time data of NFX was determined by UPLC-MS/MS. Pharmacokinetic analysis showed that after oral administration of mixed feed at the dose of 30 mg/kg, the absorption and distribution of NFX were fast, with the peak time (Tmax), absorption (T1/2Ka) and distribution half-life (T1/2α) of 3.000, 1.012 and 1.570 h, respectively. The elimination of NFX was also quick, with the elimination half-life (T1/2) of 15.267 h and total body clearance (CL) was 1.315 L/(h·kg). In addition, peak concentration (Cmax) was 1.273 mg/L, and the area under the concentration-time curve (AUC(0～∞)) was 22.67 mg/(L·h). After 3 d of successive oral administration at the dose of 30 mg/(kg·d) NFX, the elimination rate constant were 0.144, 0.125, 0.102 and 0.093 1/d in muscle, liver, kidney and plasma, respectively. In theory, the withdrawal time calculated by WT1.4 program was 22.97 d in muscle, 21.30 d in liver, 33.40 d in kidney and 18.29 d in plasma. The results provided a theoretical basis for practical applications of norfloxacin in aquatic animals.[Chinese Fishery Quality and Standards, 2016, 6(1):22-28]Key words:norfloxacin;Anguillajaponica;pharmacokinetics;residues;depletionCorresponding author:LIN Mao, linmao@jmu.edu.cn

2015-08-03；接收日期：2015-11-17

公益性行业(农业)科研专项(201203085)； 鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心开放基金(RE201507)；福建省自然科学基金(2014J01131)；海洋经济发展区域示范项目(14CZP032HJ06,14PYY050SF03)

范红照(1987-)，男，硕士，研究方向为水产动物药动学与残留检测技术，535773640@qq.com 通信作者：林茂，副教授，研究方向为水产动物病害控制，linmao@jmu.edu.cn

S948

A

2095-1833(2016)01-0022-07