水及水产品中微生物快速检测技术研究进展

向文瑾，徐瑗聪，许文涛, 2*

(1. 食品安全与分子生物学实验室,中国农业大学食品科学与营养工程学院;2. 食品质量与安全北京实验室：北京 100083)

水及水产品中微生物快速检测技术研究进展

向文瑾1，徐瑗聪1，许文涛1, 2*

(1. 食品安全与分子生物学实验室,中国农业大学食品科学与营养工程学院;2. 食品质量与安全北京实验室：北京 100083)

研究和建立水及水产品中微生物快速检测方法对人们的身体健康和食品安全风险控制有着重要意义。文章介绍了水及水产品中的主要病原微生物及其快速检测技术，其中包括微生物试纸片检测技术、PCR检测技术、等温扩增检测技术、多样性快速检测技术、生物传感器检测技术等。分析和梳理了各类快速检测技术的原理、优缺点及其应用，并对水及水产品中微生物快速检测新技术进行了展望。[中国渔业质量与标准，2016,6(1):45-52]

水及水产品；微生物；快速检测技术；食品安全

中国是水资源大国，拥有广阔的内陆水域面积，这为水产品养殖业提供了充足的条件。改革开放后，随着中国经济的迅猛发展和食品贸易的全球化，中国已成为水产品生产加工消费的大国，但随之而来的水及水产品安全问题也日益受到广泛关注。水环境的优劣和水产品的安全与否直接关系到人类健康，诸如轰动一时的1956年日本“水俣病”，2006年北京福寿螺事件等。养殖水域环境是影响水及水产品质量的重要因素，工业污水的不合理排放，为了促进水产养殖动物的生长而无节制地投放抗生素、激素类药物、违禁[1]等，以及饲料原料中违规使用添加剂等都会使养殖水体及水产品受到氮、磷、有机物、兽药残留、重金属离子、有害微生物的污染[2]。

海洋生物更易被水体中的有机污染物、农药、石油、重金属、微生物和生物毒素等污染物侵害[3]，其中微生物的危害极为严重。据世界卫生组织估计，在全世界每年数以亿计的食物中毒患者中，由于食用了各种致病性微生物污染的水和水产品而患病的患者占了极大比例[4]。在运输和储藏过程中，由于环境或操作人员的失误很有可能造成水产品的微生物污染。水中常见的微生物有细菌、真菌、原生动物、病毒、噬菌体、藻类等。其中细菌、病毒、原生动物作为通过水媒病原体，常常通过水传播进入人体引发疾病，对人类健康造成极大的损害，因误食含有有害微生物的水及水产品而引发的安全问题时有发生。

为了对水及水产品中的微生物进行有效、快速的检测，研究和建立水及水产品中微生物快速检测方法对食品安全风险控制和监管也就越来越重要。水及水产品中微生物的传统检测技术基于形态学上的差异来鉴别不同的微生物，周期较长、程序繁琐，且特异性差、不够精准，因此快速、简单、高效、高通量的检测技术已成为研究热点和发展趋势[5]。文章主要介绍了目前国内外检测水及水产品中微生物的快速检测技术，对这些快速检测技术进行了较为系统分析和总结，并对未来的快速检测技术的发展趋势进行了展望，以期在不久的将来，用更精准、更快速的检测手段对水及水产品中的主要病原微生物进行检测。

1 水及水产品中主要病原微生物

由于世界各国的发展水平差异较大，历史文化和宗教地理以及政策等也不尽相同，因而对水产品中微生物的要求也存在差异。中国对水产品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血性弧菌给出了明确的限量标准[6]。国际微生物标准委员会明确给出了水产品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌等的限量规定[7]。欧盟对水产品中单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌的含量做了明确规定[8]。美国食品药品监督管理局(FDA)和环境保护局(EPA)对水产品中单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、肉毒梭菌给出了限量标准[9]。加拿大[10]和澳大利亚[11]对水产品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌的含量给出明确规定。日本对水产品中副溶血性弧菌给出了限量标准[12]。

2.1 副溶血性弧菌

副溶血性弧菌，又被称为嗜盐菌，是革兰氏阴性多形态杆菌或稍弯曲弧菌。本菌为热敏性细菌，嗜盐畏酸。该菌在海产品中广泛存在，中国每年爆发的食物中毒事件中，因为副溶血性弧菌而引发的事件占微生物病原的首位。临床上以急性腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。目前已采用酶联免疫吸附法(ELISA)[13]、定性PCR[14]和Real-Time PCR[15]对副溶血性弧菌的毒力基因tdh和trh进行了检测。

2.2 单核细胞增生李斯特氏菌

单核细胞增生李斯特氏菌是革兰氏阳性菌，在李斯特的10个菌株中，单核细胞增生李斯特氏菌是唯一能引起人类疾病的。该菌是一种人畜共患病的病原菌，感染后主要表现为脑膜炎、败血症和单核细胞增多。在4 ℃的环境中该菌仍可生长繁殖，成为冷藏食品危害人类健康的主要病原菌之一。用PCR及PCR-ELISA对毒力基因inlA[16]、inlB[17]、prfA[18]进行了检测，用Real-Time PCR对毒力基因hly和actA[19]进行了检测，用TaqMan PCR 对毒力基因iap[19]进行了检测。

2.3 金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性的兼性厌氧菌。抗盐性好，该病菌可在盐水(也可以是海水)中大量存在。常受该菌污染的水产品有冷熏的鱼、冷冻的或熟的甲壳类动物。临床症状主要表现为呕吐、发热、腹泻。目前采用PCR方法对其毒力基因SEA-E[20]、ETA和PVL[21]进行了检测。

2.4 铜绿假单胞杆菌

铜绿假单胞杆菌，又称绿脓杆菌，是专性需氧的革兰氏阴性杆菌。该菌在水中广泛存在，即使在营养缺乏的水中仍然可以生长[22]。其临床症状主要表现为发炎、化脓、败血症和菌血症等。目前检测铜绿假单胞杆菌的方法有传统培养法、PCR法和环介导等温扩增技术(LAMP)[23]。

2.4 沙门氏菌

沙门氏菌为两端钝圆的革兰氏阴性短杆菌。极易污染冷冻的软体贝类动物、生甲壳类动物、活双壳软体动物等水产品。临床症状表现为腹泻、腹部疼痛、恶心、呕吐，常伴有中度发热，症状持续2～5 d。目前用试纸快速检测、显色培养基快速检测、PCR法、RT-PCR法、环介导等温扩增技术(LAMP)、磁免疫技术[24]和多管发酵-菌落PCR法[25]定量检测水中沙门氏菌。

2.5 产气荚膜梭菌

产气荚膜梭菌为两端钝圆的粗短革兰氏阳性菌大杆菌。产气荚膜梭菌抗热相当好，当受该菌污染的水产品做成菜冷冻后，它的孢体会滋生、繁殖和产生毒素。临床症状主要表现为恶心，有时呕吐、腹泻、腹痛、不发烧。症状持续1～2 d。其毒力基因有virR和virS等[26]。现阶段该菌采用的检测方法有多重PCR[27]和环介导等温扩增技术(LAMP)[28]。

2.6 志贺氏菌

志贺氏菌是无荚膜、无芽孢、无鞭毛的兼性厌氧革兰氏阴性杆菌。志贺氏菌在食品热处理过程中就能轻易地被杀死，在pH≤4.5时也不会存活。然而在某些条件下，志贺氏菌能在食物中能存活很长时间，如在虾和蛤类中能存活50 d。临床症状变现为恶心、腹部痉挛、腹泻、发热、，病情会持续发作1～8 d。该菌极易感染婴幼儿和体弱的老年人，而且病情严重。其毒力基因有set1A,set1B,ial和ipaH等[29]。目前采用的检测方法有PCR、酶联免疫技术(ELISA)、Real-Time PCR等[30]。

2.7 霍乱弧菌

霍乱弧菌是革兰氏阴性短菌，有单鞭毛、菌毛，部分有荚膜。该菌有139个血清群，其中O1群和O139群可引起霍乱。水产品中的贝类、鱼等常受该菌污染。霍乱弧菌曾在世界上引起多次大的流行病，临床症状主要表现为剧烈的呕吐，腹泻，失水，死亡率甚高。属于国际检疫传染病。其常见毒力基因有ctx[31]，该菌常用的快速检测方法主要有PCR、实时荧光定量PCR、酶联免疫吸附法(ELISA)、环介导等温扩增(LAMP)等[32-35]。

3 现有快速检测技术

3.1 微生物试纸片检测技术

微生物的传统检测方法是采用琼脂平板培养法，根据形态上的不同以及生理生化特征来区分鉴别不同微生物，其检测前期都需要预增菌，后期需生化鉴定、血清学分析等鉴定实验，鉴定时间需要3～7 d；需要专业人员操作，容易造成假阴性或假阳性结果等缺点；且耗时长、程序繁杂。灵敏度、特异性、时效性等方面均不能满足检测要求[36]。为了准确、高效地鉴别研究各种病原微生物，在传统检测方法的基础上发展了微生物试纸片检测技术。

微生物试纸片是将经过特殊制备的试纸和待测成分接触，放在适宜的温度下培养，因为待测成分对酶的抑制作用会产生催化显色的差异[37]，通过对有颜色菌落的计量而实现检测。试纸片的制作方法简单，纸膜由上下两层薄膜组成，上层是聚丙烯薄膜，下层是印有网格并且有培养基覆盖的聚乙烯薄膜[38]。将配置好的反应液浸渍和涂划在纸膜上然后干燥成试纸。

试纸法作为一种现场快速检测方法，因其制作成本低、使用方便、无需设备、结果显示直观等优点被广泛推广，但这种检测方法在保存性和检出限等方面存在一定的局限性，假阳性和假阴性率较高，能做定性检测，虽也能定量但定量结果只适合做食品的初筛查[37]。目前市面上较为成熟的微生物测试片生产商可检测菌落总数、大肠菌群、霉菌、酵母、金黄色葡萄球菌等[39]。

图1 微生物试纸片检测大肠菌群菌落总数Fig.1 Total bacterial count of coliformdetection by microbial test paper

3.2 PCR检测技术

PCR检测技术是基于聚合酶链反应对目的基因进行快速、特异地扩增，使其特定微量的DNA大幅增加易于检测的一种分子生物学技术[40]。PCR技术具有特异性强、灵敏度高、简便、快速的优点而被广泛应用到食品中微生物属的鉴定[41]。传统的PCR方法在目的基因扩增后还需要琼脂糖凝胶电泳分析，对目的基因的大小与数量有一定的要求且只能做到定性而非定量检测。而在此基础上研究开发的实时定量PCR技术很好地解决了这个问题，实时定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对初始未知目的片段数量进行定量分析的方法[42]。实时定量PCR不需要后续琼脂糖电泳的分析过程，在完成各种各样致病菌数目测定的同时，又大大缩短了检测时间，并降低了检测环境对扩增反应带来污染的可能性[43]。实时定量PCR技术主要采用非特异性染料和特异性探针标记两种荧光基团。非特异性染料主要指SYBR GreenⅠ,特异性探针标记主要有Taqman探针、分子信标探针、DNA杂交探针等[44-45]。实时定量检测技术已成为定量检测微生物含量的常规检测方法[46]，如在环境水中检测空肠弯曲杆菌,其检测限可达到1.0 CFU/mL[47]。霍乱弧菌,检测限可达2.6 CFU/mL[48]。大肠杆菌，其检测限是0.2 CFU/mL[49]。在此基础上也发展了其他新技术，如纳米金Real-time PCR[50]，将PCR与酶联免疫吸附(ELISA)技术相结合的PCR-ELISA检测方法[38]用于沙门氏菌的检测[49]等。

3.3 等温扩增检测技术

等温扩增技术(isothermal amplification)是近20年兴起的一项PCR技术。它克服了常规PCR需要温度梯度的障碍，在恒温的条件下实现核酸的扩增。近年来常用的等温扩增技术包括环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、链置换扩增技术(strand displacement amplification, SDA)、切口酶核算恒温扩增技术(nicking enzyme mediated amplification, NEMA)、滚环扩增(rolling circle amplification, RCA)、依赖解旋酶恒温扩增、依赖核酸序列扩增、QB复制酶扩增、转录介导扩增技术、交叉引物扩增技术等[51-53]。目前，研究者们已经将这些等温扩增技术应用到DNA同源结合上，以检测目的分子。环介导等温扩增技术是目前研究较成熟的等温扩增技术，与PCR相比，该技术只需在65 ℃恒温扩增45～60 min，即可达到109～1010数量级。反应程序简单、时间短、效率高，专一性强，不需要昂贵的热循环仪，水浴加热即可完成。满足现场快速检测的要求。日本荣研株社采用浊度法对LAMP反应过程中焦磷酸镁沉淀进行监测，实现了对LMAP的定性检测。如对日本血吸虫尾蚴[54]的检测。目前该技术已用于各种病原体的定量检测，如对沙门氏菌的检测，其检测限可达0.14 CFU/mL[55]，对副溶血弧菌的检测, 其检测限是89 CFU/g[56]。LAMP由于其灵敏度高，操作过程中极易受到污染而产生假阳性结果。所以该技术的后期开发是使整个检测过程处封闭状态中，检测结果避免假阳性的干扰。

3.4 多样性快速检测技术

变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)是于20世纪80年代提出的一种鉴定微生物多样性的分子生物学检测技术[57]。该技术现在已广泛用于环境中细菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多样性的分析。其原理是在含有从低到高的线性变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶电泳中，双链DNA片段向高浓度变性剂方向迁移，当它到达其变性要求的最低浓度变性剂处，双链DNA开始部分解链，由于解链程度与迁移速率成反比，这就导致其迁移速率变慢，由于这种变性具有序列特异性，因此DGGE能根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开[58]。DGGE操作简单，无需培养微生物，可重复，但只能检测出丰度比较高的菌种，且只能用于定性检测。

温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel electrophoresis, TGGE)也是近些年微生物分子生态学研究中的热点技术之一，已发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一，例如分析污染河流中变形菌门的多样性[59]。TGGE技术的基本原理与DGGE技术相似，含有高浓度甲醛和尿素的凝胶温度梯度呈线性增加，这样的温度梯度凝胶可以有效分离PCR产物及目的片段。相比于因化学变性剂形成梯度的DGGE技术，TGGE梯度形成更加便捷，重现性更强[60]，但也只能用于定性检测。DGGE和TGGE技术还存在某些局限性，因此结合其他分子生物学技术是诊断和评价复杂微生物群落种群结构及其动态学最有前景的技术手段。

近年来，基于分子杂交技术的分子标记法，如荧光原位杂交技术、基因芯片技术等也用于微生物快速检测中。荧光原位杂交技术凭借其灵敏、快速、使用安全、特异性好等特点，目前已用于活性污泥[61]、海洋环境[62]等中的微生物的定量检测分析，其检测限可达103～104CFU/mL。其中荧光原位杂交技术的主要特点是将分子生物学的精确性和显微镜的可视性结合起来，在直接观察到复杂环境中不同微生物个体的同时，提供关于微生物形态、数量、空间分布与细胞环境方面的信息，对微生物群落进行评价。而基因芯片技术是在大量探针分子与标记的样品分子进行杂交的基础上，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，获取样品分子的数量和序列信息。基因芯片技术也用于细菌检测和微生物群落分析[63]。

随着大规模基因组学的兴起，第二代测序技术应运而生。第二代测序大多采用大规模矩阵结构的微阵列分析技术，其原理是利用引物和DNA聚合酶或连接酶对模板进行一系列延伸扩增，通过记录连续测序循环中的光学信号获得序列信息[64]，高通量的第二代测序技术可以应用于大规模测序。测序技术可应用于微生物检测中，包括微生物的比较基因组学、细菌分类学、宏基因组学、单细胞测序等领域。目前市场上的第二代测序仪主要包括454公司基于焦磷酸测序技术的Genome Sequencer 20 System，ABI公司基于四色荧光标记寡聚核苷连续连接反应的AB SoLid sequencer。这些分子技术的出现与发展不断为水及水产品中微生物快速检测提供新的方法。

同时，随着高通量测序技术的发展，测序依赖的微生物多样性研究技术得到了广泛的应用。在此基础上研究开发的宏基因组测序技术具有高通量、高灵敏性和非靶向性。相比传统的分子生物学技术一次至多能研究10～30种微生物[65],宏基因组学一次性可以研究成千上万种微生物。并可以研究微生物群落中比例仅占0.000 01%的低丰度菌种，且检测无需设定靶细菌和引物，可以用于发现新菌种。宏基因组测序方法有16S rRNA测序和shotgun测序两种[66]。其中16S rRNA扩增子测序技术是最为常见的细菌多样性研究方法，但是该技术存在两个致命缺陷，一是在基因组提取、建库和测序过程中引入了物种组成偏差，二是由于高通量测序读长的限制，导致物种注释只能到属的水平，研究者们正在不懈努力克服该技术的这两个缺点[67]。shotgun高通量测序，此技术既可以研究微生物的物种多样性，也可以研究微生物的基因多样性，但此技术存在费用较高和测序周期较长的缺点[68]。宏基因组测序能够通过系统学分析获得水中微生物的遗传多样性和分子生态学信息以及水中生物肠道内的微生物的多样性。宏基因组学虽能对水中微生物做定量检测，但目前没有其检测限的相关报道。

3.5 生物传感器

生物传感器是一种结合分子生物原理与新材料开发的交叉领域，它主要实现生物反应信号向其他信号表现方式如：光信号，化学信号，荧光发光信号等的转化，从而能够快速，清楚地表征检测结果[69]。生物传感器目前主要有电化学传感器、光学传感器、酶传感器和免疫传感器等。微生物生物传感器检测主要是利用杂交或者扩增的原理来实现的，这些技术可以利用功能核酸结合实现信号转移和放大；也可以将等温扩增或聚合酶链式杂交(HCR)的扩增放大体系利用化学鲁米诺反应或表面等离子共振等手段实现生物检测[70-71]。生物传感器的信号转化可以实现靶标的高效、特异且灵敏的定性定量检测。同时，生物传感器检测耗时短，信号判读容易，也成为微生物快速检测技术的新的发展方向。目前已被报道可以通过生物传感器检测的微生物有肉毒杆菌(检测限为15 pg/μL)[72]和单增李斯特菌(检测限为3×102CFU/mL)[73]等。

4 展望

随着民众生活水平的提高，人们对生活质量也有了较高的要求，越来越多的人开始注重健康生活、水及水产品的安全问题得到了广泛关注。水及水产品中微生物的污染是解决水及水产品安全问题的基础。其中，鉴别水及水产品中生物危险因子既是对消费者知情权的维护，也是监管者执行处理措施的科学依据。快速检测技术因其高特异性，简便性而受到科研工作者的青睐。不仅仅微生物的核酸基因组能够作为生物分析的靶标，微生物中的其他核酸分子，例如非编码RNA[74]、microRNA等，都可以作为生物鉴定的靶标[75]。对于鉴别方法而言，数字PCR技术可以作为水及水产品中微生物精准定量检测的新“武器”[76]。近年来数字PCR在基因拷贝数变化分析(copy number variation, CNV)、单细胞基因表达、基因分型、基因定量、遗传突变检测等方面的研究取得了突破性的进展。流式细胞技术也可以在鉴定水及水产品微生物活性提供了有力证据[77]。目前已经建立了细菌总数、沙门菌、大肠埃希菌等的流式细胞仪检验方法。

不难预见，微生物快速检测技术凭借其简单、灵敏、高效、高通量的优点，会被广泛用于现场检测并作为食品安全执法人员的“有力武器”。随着食品检测技术的日新月异，水及水产品中微生物的快速检测技术将会得到巨大的发展与改进。技术的革新与发展将会大力推进食品安全的实施监控和食品安全事件的高效处理，为人民的食品安全筑造结实的壁垒。

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Progress of rapid detection technology of microorganisms inwater and aquatic products

XIANG Wenjin1, XU Yuancong1, XU Wentao1, 2*

(1. Food Safety and Molecular Biology, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University;2.Beijing Laboratory for Food Quality and Safety: Beijing 100083, China)

It is important to establish a rapid detection technology of microorganisms in water and aquatic products for human health and food safety risk control. This paper introduced the main pathogenic microorganisms in water and aquatic products and their rapid detection technologies, including microbial test paper detection, PCR detection, isothermal amplification, diversified rapid detection, biological sensor detection, etc. Afterwards, the principle, advantages, disadvantages, and applications of this technology were also analyzed. Finally, some new rapid detection technologies were prospected for microorganisms in water and aquatic products. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2016, 6(1):45-52]Key words:water and aquatic products; microorganisms; rapid detection technology; food safetyCorresponding author:XU Wentao, 06031@cau.edu.cn

2015-10-09；接收日期：2015-12-08

北京市科技新星计划(XX2014B069)；国家高技术研究发展计划(863)计划(2012AA101606)

向文瑾(1990-)，女，硕士研究生，研究方向为食品安全，xwj9033@163.com 通信作者：许文涛，副教授，博士，研究方向为食品病原微生物的检测和食用安全性评价，06031@cau.edu.cn

S94

A

2095-1833(2016)01-0045-08