HPLC法测定乌龙茶中6种儿茶素类成分含量

韦 杰 周璐炜 何金莲 谢 静

(成都医学院药学院，成都 610083)



HPLC法测定乌龙茶中6种儿茶素类成分含量

韦 杰 周璐炜 何金莲 谢 静*

(成都医学院药学院，成都 610083)

采用HPLC外标法测定乌龙茶中没食子儿茶素(EGC)、儿茶素(C)、表没食子基儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素(EC)、没食子基儿茶素没食子酸酯(GCG)、没食子酰表儿茶素(ECG)等6种儿茶素类化合物的含量。选用Shimadzu Wonda Cract ODS-2色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流动相为0.5%乙酸水溶液(A相)、乙腈(B相)，梯度洗脱：0～40 min从10% B线性上升至30% B；流速为1.0 mL·min-1，检测波长为280 nm，柱温为35 ℃。结果表明5种不同品牌的乌龙茶中EGC、C、EC、EGCG、GCG和ECG的含量分别为19.5～85.3 mg/g、152.9～376.5 mg/g、4.7～19.2 mg/g、39.4～181.9 mg/g、10.0～74.3 mg/g和15.4～64.2 mg/g，本方法可以准确地测定乌龙茶中的6个指标成分的含量，为乌龙茶质量评价提供依据。

乌龙茶 儿茶素 高效液相色谱法

乌龙茶是中国六大茶系之一，属于半发酵茶，既有绿茶的清香，又有红茶的浓郁。乌龙茶的药理作用，不但突出表现在具有分解脂肪、减肥健美的效果[1]，还有缓解心血管疾病、降胆固醇、抗氧化、抗菌、抗癌、降血糖等作用[2-5]。乌龙茶含有多种有机化学成分和无机矿物元素功效成分，其中最重要、含量最高的是儿茶素类化合物，主要包括表没食子儿茶素(epigallocatechin，EGC)、儿茶素(catechin，C)、表没食子基儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)、表儿茶素(epicatechin，EC)、没食子基儿茶素没食子酸酯(gallocatechin gallate，GCG)、没食子酰表儿茶素(epicatechin gallate，ECG)等，这6个儿茶素类化合物被认为是乌龙茶的主要活性成分[6]。目前，尚无对这6个成分进行定量分析的报道，为更全面地评价乌龙茶的品质，本研究开发了一个新的HPLC方法对乌龙茶中6种儿茶素成分的含量进行了定量测定。

1 材料与方法

1.1 材料

超声波清洗器(KH5200B，昆山禾创超声仪器有限公司)；分析天平(GA110，Ohaus)、移液器(KA0004731：100～1000 μL，KE0040836：10～100 μL)，岛津高效液相色谱系统(包含LC-20AD二元高压泵、DGU-20A3R自动脱气机、SIL-20A自动进样器、MSD-M20A二极管阵列检测器)。6个对照品表没食子儿茶素(EGC)、儿茶素(C)、表没食子基儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素(EC)、没食子基儿茶素没食子酸酯(GCG)、没食子酰表儿茶素(ECG)购买于成都普思生物科技股份有限公司，使用娃哈哈纯净水和色谱纯乙腈作为洗脱溶剂，其它试剂均为分析纯，5个乌龙茶样品均为市售商品。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱为Shimadzu Wonda Cract ODS-2(4.6 mm × 250 mm，5 μm)。流动相为0.5%乙酸水溶液(A相)、乙腈(B相)，梯度洗脱：0～40 min从10% B线性上升至30% B；流速为1.0 mLmin-1，检测波长为280 nm，柱温为35 ℃。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，理论塔板数以儿茶素峰计不低于12000。

1.2.2 对照品储备液的制备

分别取一定量的EGC、C、EGCG、EC、GCG、ECG购对照品，精密称量，用50%甲醇溶解配成相应的对照品储备液：EGC 6.2 mg/mL、C 5.1 mg/mL、EC 9.5 mg/mL、EGCG 4.9 mg/mL、GCG 4.9 mg/mL、ECG4.7 mg/mL，4 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 样品溶液的制备

取60 mg乌龙茶粉末，精密称量，至25 mL容量瓶中，加50%甲醇超声提取15 min，重复一次，合并提取液，定溶至50 mL，摇匀，0.45 μm滤过，即得。

1.2.4 线性关系

将对照品储备液按照25∶15∶6∶30∶8∶15的比例混合，得到混标工作溶液I，将其逐级稀释得到混标工作溶液Ⅱ～Ⅴ。分别吸取混标工作溶液I～Ⅴ10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.5 重复性试验

取同一乌龙茶粉末6份，精密称量，分别按照“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按照“1.2.3”项下色谱条件测定，计算重复性试验结果。

1.2.6 回收试验

取同一乌龙茶粉末9份，精密称量，分为3组，每组紧密加入相当于已知含量50%、100%和150%的对照品储备液，分别按照“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按照“1.2.3”项下色谱条件测定含量，计算加样回收率。

1.2.7 样品测定

分别取不同品牌的乌龙茶样品，按照“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，将供试品溶液注入色谱仪，记录色谱图。

2 结果与讨论

2.1 分析条件的选择

本试验比较了多种溶剂洗脱系统，包括乙腈-水、甲醇-水、乙腈-酸性水溶液、甲醇-酸性水溶液，结果表明甲醇系统的基线漂移较为显著，而酸性水溶液的使用可以避免色谱峰拖尾，提高对称性，因此最终采用乙腈-0.5%乙酸水溶液作为流动相。对于检测波长选择，210 nm处色谱图的基线漂移非常严重；而对样品在200～400 nm全扫描，可发现EGCG、GCG和ECG在280 nm处有一个明显的强吸收，如图1所示。

虽然EGC、C、EC在280 nm的吸收强度不如250 nm处，但是考虑到280 nm处的基线更加平稳，因此选择280 nm作为检测波长。本试验尝试了不同的柱温(20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃)和不同的流速(0.8 mLmin-1、1.0 mLmin-1、1.2 mLmin-1、1.4 mLmin-1)对分离的影响，结果表明，柱温和流速虽然会使色谱峰整体移动，但对色谱峰的峰形和分离度影响不大，综合考虑，最终选择35 ℃作为柱温，流速为1.0 mLmin-1。综合上述筛选，确定色谱条件，对照品和样品色谱图如图2所示。

2.2 方法学考察结果

结果表明，6个儿茶素类对照品线性关系良好，标准曲线分别为：EGCy= 6164824x- 86223,r2=0.9992；Cy= 2390074x+ 33789,r2=0.9995；ECy= 5080708x+ 5066,r2=0.9995；EGCGy= 6161781x- 83967,r2 =0.9993；GCGy= 4750767x- 4905,r2=0.9994；ECGy= 5545450x+ 2810,r2 =0.9998；对同一乌龙茶的6份样品重复性试验结果表明重复性良好，EGC、C、EC、EGCG、GCG和ECG的RSD分别为：2.28%、1.02%、1.62%、1.42%、1.95%和0.91%；对同一乌龙茶的9份样品进行加样回收实验，EGC、C、EC、EGCG、GCG和ECG的平均回收率(n=9)分别为：99.06% (RSD=2.84%)、99.08% (RSD=1.68%)、99.32% (RSD=1.96%)、99.20% (RSD=2.04%)、99.49% (RSD=2.19%)、99.29% (RSD=1.88%)。方法学考察结果说明本方法满足定量分析的要求，准确可靠，可以用于乌龙茶样品中儿茶素类化合物的含量测定。

2.3 样品测定结果

按外标法计算样品中儿茶素的含量(表1)，所测定的5种不同品牌的乌龙茶中EGC、C、EC、EGCG、GCG和ECG的含量分别为19.5～85.3 mg/g、152.9～376.5 mg/g、4.7～19.2 mg/g、39.4～181.9 mg/g、10.0～74.3 mg/g和15.4～64.2 mg/g。通过对乌龙茶中6种指标成分的准确定量，分析各批样品成分含量差别，可为乌龙茶质量评价提供依据。

表1 不同乌龙茶样品中儿茶素含量测定结果 mg/g

[1] Zhu J C, Chen F, Wang L Y, et al. J Agri Food Chem, 2015, 63(34): 7499-7510.

[2] Hosoda K, Wang M F, Liao M L, et al. Diabetes Care, 2003, 26(6): 1714-1718.

[3] Zhang X, Wu Z F, Weng P F. J Agri Food Chem, 2014, 62(41): 10046-10054.

[4] Zhu Q Y, Hackman R M,Ensunsa J L,et al. J Agri Food Chem, 2002, 50(23): 6929-6934.

[5] 蓝雪铭, 刘志彬, 倪莉. 中国食品学报, 2014, 14(2): 201-207.

[6] Chen Y L, Duan J, Jiang Y M, et al. Food Rev Int, 2010. 27(1): 1-15.

Simultaneous determination of six catechins in Oolong by HPLC.

Wei Jie, Zhou Luwei, He Jinlian, Xie Jing

*(SchoolofPharmacy,ChegnduMedicalCollege,Chengdu610083,China)

HPLC separation was performed on a Shimadzu Wonda Cract ODS-2 analytical column (250 mm×4.6 mm, 5 μm). with a flow rate of 1.0 mL·min-1. while the column temerature was 35 ℃. The mobile phase consisted of water containing 0.5% acitic acid (A) and acetonitrile (B) with a linear gradient elution of 10%-30% B for 40 min. The detection wavelength was 280 nm. The contents of EGC, C, EC, EGCG, GCG and ECG were 19.5-85.3 mg/g, 152.9-376.5 mg/g, 4.7-19.2 mg/g, 39.4-181.9 mg/g, 10.0-74.3 mg/g and 15.4-64.2 mg/g, respectively.

Oolong; catechins; HPLC

四川省2015大学生创新训练项目(No. 201513705078)，四川省教育厅科研计划(No. 16ZA0299)

韦杰，男，1994年出生，本科生。

谢静，女，1979年出生，博士，讲师，主要从事天然产物活性成分研究，Email: aggie-xj@163.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.06.012

2016-05-15