固相萃取-高效液相色谱法测定蔬菜中残留的敌菌灵和苯甲酰脲类杀虫剂

徐秋生 刘 俊 贺慧琳 吴爱红

(平湖市食品药品检测中心，平湖 314200)



固相萃取-高效液相色谱法测定蔬菜中残留的敌菌灵和苯甲酰脲类杀虫剂

徐秋生 刘 俊 贺慧琳 吴爱红

(平湖市食品药品检测中心，平湖 314200)

建立了采用固相萃取-高效液相色谱法测定蔬菜中残留的敌菌灵和苯甲酰脲类杀虫剂(除虫脲、灭幼脲、杀铃脲、氟铃脲、氟苯脲和氟啶脲)的方法。蔬菜样品用乙腈均质法提取盐析后脱水，经Florisil固相萃取柱净化，正己烷/丙酮(85/15，V/V)淋洗，洗脱液浓缩定容后经液相色谱分离与检测，外标法定量。结果表明，各组分农药的加标回收率在83.5%～105.6%之间，变异系数(CV)在3.05%～9.56%之间，最低检出限0.02～0.04mg/kg，满足蔬菜中残留的敌菌灵和苯甲酰脲类杀虫剂的检测要求。

固相萃取 高效液相色谱 蔬菜 敌菌灵 苯甲酰脲类杀虫剂

敌菌灵是由三聚氰酰氯与邻氯苯胺在脱酸剂存在下作用而得到的一种杀菌剂，其化工产品学名为2，4-二氯-6-(邻氯代胺基)均三氮苯，具有低毒、内吸性和杀菌谱较广等特点[1]，对交链孢属、尾孢属、 葡柄霉属、葡萄孢属等真菌特别有效，广泛用于粮食、蔬菜等农作物，防治水稻胡麻叶斑病，瓜类的炭疽病、霜霉病、黑星病和各种农作物的灰霉病。苯甲酰脲类杀虫剂属几丁质合成抑制剂，主要通过抑制昆虫蜕皮，变态导致不育及直接杀卵等作用来控制害虫的繁衍[2]。目前在用的主要有除虫脲、灭幼脲、杀铃脲、氟铃脲、氟苯脲和氟啶脲等，该类农药与有机磷、氨基甲酸酯、菊酯类等杀虫剂之间无交互抗性且防虫效果更佳，在粮食、蔬菜等农作物得到广泛应用[3]。近年来随着现代农业和社会的发展，各类农药在农作物生长过程中的广泛使用，不可避免带来农药残留问题以及对人类在存潜在的危险，农药残留危害已引起更多人的关注，世界先进国家和地区都制定了严格的农药残留限量标准，包括CAC、欧盟、美国和日本均有现行标准，我国在GB 2763-2014《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》[4]中对于敌菌灵和苯甲酰脲类杀虫剂作了明确的限量规定。

农药残留分析的样品种类繁多，化学组成复杂，要使分析仪器能检测到痕量的残留农药，必须对样品进行必要的提取、浓缩和净化处理[5]。固相萃取是近年发展起来一种样品预处理技术，由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展而来，能有效的将分析物与干扰组分分离，减少样品预处理过程，操作简单、省时、省力，现已广泛应用于农药残留的分析中[6]。目前，测定粮食、蔬菜中敌菌灵和苯甲酰脲类杀虫剂农药残留量的检测方法报道比较多，主要包括高效液相色谱法[7，8]、高效液相色谱质谱联用法[9]和气相色谱质谱联用法[10]等，但这些检测的报道多以敌菌灵或苯甲酰脲类杀虫剂单一品种农药进行检测，同时测定蔬菜中敌菌灵和苯甲酰脲类杀虫剂农药残留的研究尚未见报道。本实验建立了采用固相萃取-高效液相色谱法测定蔬菜中残留的敌菌灵和苯甲酰脲类杀虫剂的分析方法，并做了方法确认实验，为快速检测蔬菜中敌菌灵和苯甲酰脲类杀虫剂农药残留进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

敌菌灵、除虫脲、灭幼脲、杀铃脲、氟铃脲、氟苯脲、氟啶脲标准品(纯度≥98.0%，德国Dr.Ehrenstorfer)；甲醇、乙腈、丙酮、正己烷(色谱纯，德国Merck)；氯化钠(分析纯，国药集团)；Cleanert Florisil柱(1000mg/6mL，天津Agela)；Cleanert Alumina-N柱(1000mg/6mL，天津Agela)；WondaSep Si硅胶小柱(500mg/6mL，日本岛津)；有机微孔滤膜(0.22μm，天津Agela)；超纯水(实验室自制)。

UltiMate 3000高效液相色谱仪(美国，Thermo Fisher公司)；TurboVapLV型全自动定量浓缩仪(瑞典，Biotage公司)；T25高速均质机(德国，IKA公司)；LD4-2A离心机(北京医用离心机厂)；Milli-Q Advatantage A10超纯水机(法国，Merck Millipore公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

分别准确称取敌菌灵、除虫脲、灭幼脲、杀铃脲、氟铃脲、氟苯脲和氟啶脲7种农药标准品10mg至10mL的棕色容量瓶中，用甲醇配成浓度约为1000 mg/L单标标准贮备液，-18℃保存，备用。吸取7种单标农药标准贮备液适量，置于棕色容量瓶中，用甲醇稀释成浓度为25mg/L农药混合标准溶液，-18℃保存，备用。

1.2.2 样品前处理

称取粉碎均匀的蔬菜试样15 g(精确至0.01 g)于100 mL聚丙烯(PP)塑料离心管中，加入30.0mL乙腈，均质机高速均质2min，4000r/min离心5min，取上清液倒入预先称取3～5g氯化钠的100 mL聚丙烯(PP)塑料离心管中，盖上塞子，剧烈振荡1min，静置30min，使乙腈相和水相充分分层。从离心管中吸取10.0mL乙腈溶液至15mL玻璃样品管中，置于全自动定量浓缩仪80℃水浴氮吹蒸发近干，加入2.0mL正己烷涡旋混匀待净化。依次用5.0mL正己烷/丙酮(85/15，V/V)淋洗液和5.0mL正己烷预淋洗Florisil(1000mg/6mL)小柱，弃去流出液，当正己烷液面层到达柱吸附层表面时，立即移入待净化样品液，用15mL玻璃样品管接收洗脱液，5.0mL正己烷/丙酮(85/15，V/V)洗脱液清洗样品管后淋洗小柱，并重复两次。将盛有洗脱液样品管置于全自动定量浓缩仪上，水浴50℃氮吹蒸发近干，加入2.0mL甲醇涡旋混匀，过0.22μm有机微孔滤膜，上液相色谱测定。

1.2.3 液相色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相A为乙腈，流动B为水，洗脱程序0～20min，A从45%线性增加至100%， 20～22min保持A为100%，22～24min A线性减少至45%，23～30min保持A为45%；柱温：30 ℃；流速：0.8 mL/min；检测器：二极管阵列(DAD)；紫外检测波长：250 nm；进样量：20 μL。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

取农药混合标准溶液，上机分析，在190nm～400nm范围内进行波长扫描，获得7种农药的紫外吸收光谱重叠图(见图1)，从光谱图上可以看出7种农药在250 nm～260nm波长范围内均有较强紫外吸收峰，综合比较后选择260nm为本方法的色谱检测波长。

2.2 提取溶剂的选择

在农药残留分析中，乙腈、丙酮和乙酸乙酯是3种常用的提取溶剂，本实验选择黄瓜空白样品中添加农药混合标准溶液，测定各组分农药的回收率，比较了3种提取溶剂的提取效率，结果见图2。由图2可见，3种溶剂的回收率均能满足农残分析要求，但是与乙腈相比较，丙酮和乙酸乙酯溶出的杂质和色素较多，对后续的净化处理有较大的影响。本实验最终选用乙腈作为提取溶剂，7种农药回收率均在90%以上。

2.3 净化方式的选择

农药残留分析常用的前处理方法有液-液萃取(MLLE)、固相萃取(SPE)、超临界流体萃取(SFE)和凝胶渗透(GPC)等，本实验选用固相萃取法比较了Cleanert Florisil柱、WondaSep Si柱和Cleanert Alumina-N柱3种不同固相萃取柱对于黄瓜空白样品的净化效果及回收率，从图3中可以看出3种固相萃取柱回收率都能满足农残分析要求，相比较Cleanert Florisil柱和Cleanert Alumina-N柱的回收率优于WondaSep Si柱，实验最终选择传统的Florisil柱作为净化用固相萃取柱。

2.4 标准曲线与检出限

吸取农药混合标准溶液，用甲醇逐级稀释配制成浓度为0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0mg/L系列标准工作溶液，上机测定，以标准工作溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程。用甲醇逐级稀释各组分农药标准溶液，以3倍信噪比(S/N)计算最低检出限，结果见表1。从表1可见，7种农药在0.05～5.0 mg/L浓度范围内线性关系良好，线性相关系数均大于0.999。

2.5 加标回收率与精密度试验

称取粉碎均匀的黄瓜空白试样15 g(精确至0.01 g)，分别添加0.04mg/kg、0.1mg/kg和1.0mg/kg 3个不同水平的农药混合标准溶液，按上述条件进行前处理，测定样品中各组分农药的含量，每个添加浓度重复测定6次，计算加标回收率和变异系数(CV)，结果见表2。各组分农药的加标回收率在83.5%～105.6%之间，变异系数(CV)在3.05%～9.56%之间，符合农药残留分析要求。黄瓜空白样品和黄瓜加标样品的色谱图见图4、图5，由色谱图可见，经过Florisil柱净化后色素能被有效吸附，在上述色谱条件下，各组分农药分离较好，无杂质干扰，能够满足敌菌灵和苯甲酰脲类杀虫农药残留的检测。

表2 回收率与精密度试验(n=6)

2.6 蔬菜样品的测定

采用本方法对某蔬菜批发市场销售的不同品种的蔬菜样品进行了敌菌灵和苯甲酰脲类杀虫7种农药残留的检测，每个品种选择了3个不同的基质，并用二极管阵列(DAD)检测器收集紫外谱图进行定性分析，检测结果见表3。由表3可见，氟铃脲和杀铃脲2种农药在被检蔬菜样品中未检出，其余5种农药均有检出，但符合GB 2763-2014《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[4]最大残留限量要求。

表3 蔬菜样品中7种农药残留检测结果 mg/kg

3 结论

采用固相萃取-高效液相色谱法测定蔬菜中残留的敌菌灵和苯甲酰脲类杀虫剂，各组分农药的加标回收率在83.5%～105.6%之间，变异系数(CV)在3.05%～9.56%之间，符合农药残留分析要求，方法操作简单快速，准确可靠，使用本方法完全可以满足蔬菜中敌菌灵和苯甲酰脲类杀虫剂的日常检测要求。

[1] 刘宁,李健,刘涛.食品中敌菌灵残留分析研究进展[J].食品研究与开发,2007,28(11): 155-157.

[2] 何康.中国农业百科全书:农药卷.北京:中国农业出版社,1993:10.

[3] 何红梅,吴俐勤,章虎,等.蔬菜中苯甲酰脲类药物残留的测定方法研究[J].分析化学,2006, 34(10):1379-1383.

[4] GB 2763-2014 食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量[S].

[5] 刘士华,王兴征,侯淑云,等.农药残留检测前处理步骤及其质量控制[J].北京农业,2014(15): 5-6.

[6] 胡宝文,安尔松.固相萃取在农药残留分析中的应用[J].天津农业科学,2006(1):41-41.

[7] 李健,刘宁,陈平,等.食品中敌菌灵残留量的HPLC测定方法研究[J].食品科学,2007,28(1): 278-281.

[8] 唐庆强,李捷,傅爱华,等.高效液相色谱法测定果蔬中多种苯甲酰脲类农药残留[J].分析试验室,2010,29:269-271.

[9] 丁慧瑛,谢文,周召千,等.蔬菜中11种苯甲酰脲类农药残留的液相色谱-串联质谱法测定[J].分析测试学报,2009,28 (8):970-974.

[10] 罗祎,李立,袁宗辉,等.粮谷中敌菌灵的GC-MS检测方法研究[J].食品科学,2008,29(12):544-546.

Determination of anilazine and benzoylurea insecticides pesticide residues in vegetables by solid phase extraction and high performance liquid chromatography.

Xu Qiusheng, Liu Jun, He Huilin ,Wu Aihong

(PinghuFoodandDrugInspectionCenter,Pinghu314200,China)

The sample was homogeneously extracted by acetonitrile with salting out and dehydration. After purification on the Florisil solid phase extraction column, eluted with Hexane/Acetone (85/15,V/V), the eluent was concentrated and diluted for high performance liquid chromatography analysis,measured by the external standard.The results showed that the recoveries of pesticides were between 83.5%-105.6%, and the coefficient of variation(CV) ranged from 3.05% to 9.56%, the lowest detection limit was 0.02-0.04mg/kg. The method can meet the detection requirements of anilazine and benzoylurea insecticides residues in vegetables.

solid phase extraction; high performance liquid chromatography; vegetables; anilazine; benzoyllurea insecticides

徐秋生,男，1979年出生，工程师,研究方向:食品、农产品仪器分析与测试，E-mail: xuqsh@163.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.06.005

2016-05-23