马钱子对脐血源性神经干细胞巢蛋白mRNA表达的影响

陈敬国+鄂桂娟+方慧云

【中图分类号】R615 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2016）12-0-01

巢蛋白表达最初开始于胚胎早期的神经前体细胞，在胚胎脑中主要以时空序列的方式进行表达，当前巢蛋白已经成为神经肝细胞的标记蛋白，常常被用于神经干细胞的分离、鉴定以及培养中[1]。巢蛋白 mRNA 在哺乳类动物中枢神经系统发育中的表达具有区域相关性，其表达的强弱可反映某些区域内神经细胞的增殖活性[2]。本文笔者运用采用RT-PCR方法对脐血单个核细胞培养前后及马钱子诱导培养后巢蛋白mRNA表达进行检测，现将试验方法和试验结果简单汇报如下：

1.资料与方法

1.1 材料

1.1.1 脐血来源。脐血主要是用肝素抗凝采血袋从本院产科无菌收集健康产妇足月妊娠顺产或剖宫产的婴儿脐带血50～100ml，性别不限，均获得产妇极其家属同意用于科研中，并且获得我院伦理委员会的同意，签署了知情同意书，所有产妇均身体健康、无结核、肝炎、获得性免疫缺陷综合症、梅毒等传染病，新生儿均无先天性畸形。将脐血充分混匀后，置保温盒中。

1.1.2 主要试剂。DMEM培养基购自Gibco公司。新生牛血清：杭州四季青生物工程材料研究所产品。淋巴细胞分离液（1.077 g/cm3）：天津血液病研究所产品。琼脂糖为Sigma公司产品。RNA提取试剂盒为上海生物工程公司产品，RevertAidTM First StrandcDNA Synthesis Kit为MBI Fermentas公司产品。其他PCR试剂均购自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 脐血MNCs的分离方法。密度梯度离心法分离脐血MNCs。用酒精棉球擦拭采血袋的塑料导管，以无菌手术剪刀剪断塑料管，然后将血袋内的抗凝脐血导入一250 ml无菌生理盐水瓶中，用无菌的PBS（pH7.0）等体积稀释，轻轻震荡摇匀。取数个50 ml的无菌带盖离心管，先加入1.077 g/cm3的淋巴细胞分离液20～25 ml，无菌吸管吸取稀释后的脐血25～30ml，离液面约1 cm处缓慢加入，应形成一明显的界面，上下液体勿混合。2 000 r/min离心25 min，小心吸取中间的白膜层。加入7～10倍体积的PBS缓冲液，1 000 r/min、10 min离心洗涤3次，弃上清。所得MNCs经台盼蓝染色、光学显微镜下计数，调整至适当细胞密度用于细胞培养，并冻存部分细胞于液氮中备用[3]。

1.2.2 细胞培养与收集 以1.0×106ml-1（T-25培养瓶）的密度接种于含体积分数20%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃、含体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱内培养。在培养过程中，每3 d换液1次。15 d后，培养物在200 r/min摇动约30min，收集、离心洗涤细胞；将冻存的未培养的细胞解冻、离心洗涤。在显微镜下，台盼蓝染色、计数，调整细胞密度备用。另一组细胞加用马钱子粉。

1.2.3 引物设计与合成 采用相关软件设计RT-PCR引物。nestin引物（上游引物N1：5-AGG ATG TG AGGTAGTGAGA-3，下游引物N2：5-TGGAGATCTCAGTGG CTCTT-3），内对照β-actin引物（上游引物A1： 5-GGC ATG GGT CAG AAG GATTCC-3，下游引物A2：5-ATGTCA CGC ACG ATTTCC CGC-3）。均由上海生物工程公司合成。

1.2.4 RT-PCR RNA提取及cDNA合成参照试剂盒说明进行。在完成cDNA合成之后进行PCR扩增。在Ependoff管中依次加入下列物质：10 mmol/L 4×dNTP 1 ml，Taq酶0.5 ml （5 u/ml）， cDNA5 ml，特异性引物1、2各1 ml，内对照引物0.3 ml， 10×缓冲液5 ml， ddH2O36.2 ml。PCR扩增条件为：94℃1 min， 94℃30 s，57℃30 s，72℃30 s，40个循环后，72℃延伸7 min。

1.2.5 扩增产物的检测 取10ml加有载样缓冲液的扩增产物加样至含有溴化乙锭（EB）、质量分数为2%的琼脂糖凝胶中，在电压5～10 V/cm下电泳60min后，置紫外透射仪下观测结果，并利用凝胶扫描成像系统照相[4]。

2.结果

2.1 脐带MNCs的形态极其活性

每一根脐带分离到的MNCs数量为（4.13—6.41）×105个/L，细胞的活性高达96.71%—99.72%。运用倒置相差显微镜进行观察，新鲜分离出来的MNCs胞体表现为圆形，将其接种大约48小时左右，有近25%的细胞由圆形变成了梭形，并且细胞开始贴壁，在72小时偶贴壁细胞的数量不断增多，而发生细胞形态变化明显，最终表现为长梭形，彼此之间紧密排列在仪器。在细胞培养10天后，可以看到1-2个HP胞体较大，还可以发现一些放射状的突触神经样细胞，并且各个细胞表现的形态也不尽相同，具体如图1所示。在培养30天后，细胞表现出不规律生长，因此无法根据其形态进行判断。

2.2 脐带血源MNCs巢蛋白的mRNA表达分析

具体表达情况如如图2所示。没有培养的原代细胞和传代细胞的巢蛋白mRNA均表现为阳性，原代细胞巢蛋白的mRNA相对表达量为2.64±0.42，第一代细胞的表达量为1.71±0.19，第二代细胞的表达量为0.26±0.06。

3.讨论

巢蛋白在多器官、多细胞均有分布，尤以胚胎期分布为广泛，目前已可在胚胎干细胞可分化的几乎所有类型的组织细胞中发现表达，如神经系统、胰腺、肝脏、心肌、骨骼肌、牙齿、肾上腺、发囊、皮肤、睾丸和胃肠道及多系统肿瘤均有分布。王军[5]等学者经过试验证实脐带中的MNCs总量常常高于血液和羊水中的总量，跟骨髓血中提取的MNCs比较相似，都具有多向分化的功能，这跟国外Lee[6]等学者的研究结果一致。

马钱子原名番木鳖，为马钱科马钱子属植物马钱及云南马钱的干燥成熟种子。临床应用非常广泛，化学成分含有多种生物碱，番木鳖碱（即士的宁）为马钱子的最主要成分。约占总生物碱的45%。士的宁对整个中枢系统都有兴奋作用。首先兴奋脊髓的反射机能，其次兴奋延髓的呼吸中枢及血管运动中枢，并能提高大脑皮质的感觉中枢机能。小剂量的士的宁能加强皮质的兴奋过程，促使处于抑制状态的患者苏醒，还能提高味觉，触觉，听觉和视觉等感官器官的功能。

在本文中，笔者运用采用RT-PCR方法对脐血单个核细胞培养前后及马钱子诱导培养后巢蛋白mRNA表达进行检测来探讨马钱子对脐血原性神经干细胞巢蛋白mRNA表达产生的影响，结果发现，脐血MNCs呈巢蛋白mRNA阳性表达，并且其表达量在传代后数量明显减少.该研究结果跟乌优图，王运杰[7]等研究结果一致。但是这并非意味着细胞中神经前体细胞的数量在减少，其主要是因为：首先上述变化跟巢蛋白在神经前体细胞向神经细胞分化时表现出来的变化是一致的，其次是发生的该变化可能跟细胞的横向分化存在关联。有研究指出[8]：脐血细胞在培养8天后能够发现少数表现出放射状突起类似神经样细胞的生长形态，这些突出的形态跟树突、轴突等形态相似，即便在传代以后，依然有类似的细胞产生，但是在传代5次之后，绝大部分的细胞表现为表皮样生长或者无规则形态生长，无法找到神经样细胞，这对这种情况可能是MNCs自发分化成神经前体细胞导致的，但是这些神经样细胞在移植之后是否能够表现出神经元功能还有待研究。

综上所述，利用无菌的产妇足月妊娠顺产或剖宫产的婴儿脐带血分离培养的原代细胞具有巢蛋白mRNA的表达，并且其传代以后的基因也依然有表达，如此便证实了其具有分化成神经细胞的潜能，虽然在传代之后的数量有一定程度减少，但是依然可以作为稳定、可靠的细胞供体，不仅如此，根据MNCs培养时出现的各种形态的类神经样细胞，如此便证实了MNCs中可能存有一定的神经前体细胞，并且该细胞今后还有可能成为治疗神经系统疾病的种子细胞之一。

参考文献

[1]齐凯，董丽媛，陈显久.人脐带来源间充质干细胞分离培养方法的优化[J].中国组织工程研究与临床康复. 2011.15（23）4220-4224.

[2]陈海，王军，范亚珍，等. 人脐血源性神经干细胞中Nestin基因的表达及意义[J].实用儿科临床杂志，2010，25（19）：1503-1505.

[3]Suzuki S Nanki .J Shibata S et al The neural stem/progenitor cellmadcernestin is expressed in proliferative endothelial cells but not in mature vasculaiure[J].J Histochen Cytochen，2010，58（8）：721-730.

[4]周华威， 赵宝东， 文普帅. 神经生长因子对局灶性脑缺血神经干细胞巢蛋白表达及细胞类型的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，2（7）：1222-1224.

[5]王军，范亚珍，陈海，等.脐血单个核细胞诱导的神经干细胞中Foxgl和Nestin基因的表达及其相互关系[J].实用儿科临床杂志，2010，25（11） ：848-850.

[6]Lee ，J W ， Krasnodembskaya A，et al. Concise，review ：Mesenchymal stem cells for acute lung injure：role of paracrine soluble factors [J].Stem Cells. 2011.29（6）：913-919.

[7]乌优图，王运杰. 神经生长因子对神经干细胞分化及神经元轴突形成的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12（29）：5631-5635.

[8]Woodbury D， Scbwarz EJ，Prockop DJ，et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons[J].J Neuro Res， 2000，61（4）：364-364.