318例中国汉族非综合征性耳聋患者基因突变谱分析①

王屹，陈蕾，刘志忠，张海燕，马娟

318例中国汉族非综合征性耳聋患者基因突变谱分析①

王屹1,2，陈蕾1,2，刘志忠1,2，张海燕3，马娟3

目的应用基质辅助激光解析/离子化飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)对先天性非综合征性耳聋患者进行耳聋基因筛查。方法采集2015年10月～2016年4月318份先天性非综合征性耳聋患者抗凝静脉全血，应用多重聚合酶链式反应(PCR)和MALDI-TOFMS的方法进行中国人常见的四个耳聋基因GJB2、SLC26A4、GJB3、线粒体12Sr RNA共20个位点的突变检测。结果共检出GJB2基因突变111例(34.9%)，其中235delC的突变携带率最高(25.47%)；SLC26A4基因突变43例(13.5%)；GJB3基因突变3例(0.94%)；线粒体12Sr RNA基因突变12例(3.77%)。结论确定不同非综合征性耳聋人群相关基因突变谱，对于建立先天性耳聋患者理想的基因筛查方法意义十分重要。

非综合征性耳聋；基因突变；基质辅助激光解析/离子化飞行时间质谱

[本文著录格式]王屹，陈蕾，刘志忠，等.318例中国汉族非综合征性耳聋患者基因突变谱分析[J].中国康复理论与实践, 2016,22(12):1451-1454.

CITED AS:Wang Y,Chen L,Liu ZZ,et al.Mutation spectra of genes in 318 Chinese Han population w ith nonsyndrom ic hearing loss[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(12):1451-1454.

听力受损是目前最常见的神经感觉性障碍，世界范围内儿童发病率约为1‰[1]。耳聋是我国第一大残疾，听力残疾者约2800万，占总残疾人口的1/3。根据原卫生部发布的《中国出生缺陷防治报告(2012)》[2]，我国每年新发先天性听力障碍3.5万例，其中遗传因素所致的耳聋约占60%，加上迟发型耳聋和药物性耳聋患者，每年新增的听力障碍儿童超过6万。遗传因素所致的耳聋中，77%～99%是常染色体隐性遗传，表现为典型的语前聋；大约10%～20%是常染色体显性遗传，其余病例与X-性连锁和线粒体遗传相关。

遗传性耳聋又分为综合性和非综合征性耳聋(nonsyndrom ic hearing loss,NSHL)，以听力受损为唯一症状的非综合征性耳聋大约占70%。从上世纪90年代开始，耳聋相关基因研究日益增加。2014年非综合征性耳聋定位已经超过170个基因座，涉及90个基因，到2016年涉及的基因近110个[3-5]。部分基因异常所致耳聋并非先天性的，而是婴儿出生之后逐步形成或者使用药物不当所致。因此，新生儿出生时单纯进行听力筛查难以排除此类致聋因素，还需辅以基因检测[6-8]。通过对基因的识别可以及早干预、预防先天性耳聋出生缺陷，控制药物致聋风险，预防或者延缓耳聋的发生发展。

目前的研究表明，与中国人遗传性耳聋最为密切相关的耳聋基因为GJB2、SLC26A4、GJB3、线粒体12Sr RNA。本研究收集318份山东临沂和湖北宜昌的耳聋患者全血血样，通过应用多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)结合飞行时间质谱对样本GJB2、SLC26A4、GJB3、线粒体12Sr RNA四个基因20个常见突变位点进行检测。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2015年10月～2016年4月湖北宜昌特殊教育学校、山东临沂特殊教育中心耳聋患者的全血血样。

纳入标准：无其他遗传性疾病耳聋；非综合征性耳聋。

排除标准：外伤性耳聋、存在其他基因相关疾病及综合性耳聋。

所有研究对象为汉族人，且均对本项研究签署知情同意书。采集耳聋患者外周血2m l，乙二胺四乙酸(ethylene diam ine tetraacetic acid,EDTA)抗凝。

1.2 突变分析

应用核酸提取试剂(上海百傲科技服份有限公司)进行全血样本DNA的提取。提取的DNA样本保存于-20℃。应用耳聋相关基因检测试剂盒(微阵列芯片-飞行时间质谱法)(北京毅新博创生物科技有限公司)。DNA样本进行PCR，反应条件为：95℃30 s，56℃30s；72℃60 s，45个循环；最后72℃300 s。PCR扩增后，加入虾碱酶(shrimp alkaline phosphatase, SAP)消化，延伸；将装有延伸混合物、SAP酶消化产物的PCR管/孔置于PCR扩增仪内。用树酯进行纯化，将纯化产物进行靶板点样，并应用基质辅助激光解析/离子化飞行时间质谱(北京毅新博创生物科技有限公司)进行样本的相关基因突变分析。

2 结果

共收集先天性非综合征性耳聋患者318例，其中男性173例，女性145例；0～13岁145例，14～25岁173例，平均(14±4.8)岁；山东临沂市158例，湖北宜昌市160例。

本研究共检测四个基因包括20个位点的突变情况。318例耳聋患者中，GJB2基因突变的比例最高，有111例(34.9%)；SLC26A4基因突变次之，有43例(13.5%)；GJB3基因突变的有3例(0.94%)；线粒体12Sr RNA突变的有12例(3.77%)。见表1。

表1 四个耳聋基因突变的检测结果〔n(%)〕

GJB2基因中，235delC位点杂合突变43例(13.52%)，纯和突变38例(11.95%)；其次为299_ 300delAT，杂合突变24例(7.55%)，纯和突变1例(0.31%)；176_191del16位点的杂合突变为5例，未检测到纯和突变。其余两个位点167delT、35delG未检测到突变。

SLC26A4基因中，突变水平最高的是IVS7-2，共29例(9.12%)，其中杂合突变为18例(5.66%)，纯和突变为11例(3.46%)；其次为2168A＞G位点，检测到5例(1.57%)杂合突变，其中2027T＞A、281C＞T两个位点在318例患者中未检测到突变。

GJB3基因中，538C＞T和547G＞A的突变比例均较低，分别检测到1例(0.31%)和2例(0.63%)。

线粒体12Sr RNA基因中，1555A＞G的同质突变比例最高，共9例(2.83%)，检测到1例异质突变(0.31%)。见表2。

有23例患者同时检测到GJB2基因的两个位点突变，有5例患者同时有SLC26A4基因的两个突变位点，2例患者同时出现GJB2基因和SLC26A4的突变位点。

表2 四个耳聋基20个突变位点检测结果〔n(%)〕

3 讨论

分子生物学方法是目前遗传性耳聋诊断的主要手段，目前国内外建立了很多耳聋基因的筛查方法，但无论是被人们认为是金标准的Sanger测序，还是其他如多限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)基因芯片技术、高效液相色谱技术等技术，都存在检测效率低、成本高的问题。传统序列方法对于不明确突变热点的疾病筛查往往无效。飞行时间质谱技术以其高灵敏度、高特异性、高准确度、多重基因检测的优势得到全球医学界的认可，成为分子诊断行业继PCR技术、芯片技术、测序技术之后最新得到美国食品和药物管理局认可的基因诊断平台。本研究应用多重PCR技术结合MALDI-TOFMS技术检测国人常见的四种基因20个位点的突变情况。

GJB2是1997年报道的第一个导致常染色体隐性遗传耳聋的基因[9]，编码连接蛋白26(connexin 26, Cx26)，是耳蜗缝隙连接的重要蛋白。该基因突变所致的耳聋临床表现为先天性重度以上感音神经性耳聋，治疗以人工耳蜗移植效果较好。耳聋基因GJB2的突变率在高加索人种常染色体隐性遗传非综合征性耳聋中大约占50%，世界其他地区明显低于该水平[10-11]。其中C.35delG突变在大部分高加索人种的携带频率最高，大约占GJB2基因突变的70%[12]。

中国人GJB2基因突变常见突变位点为235delC、299-300delAT、176_191del16、35delG、167delT。本研究对318例先天性非综合征性耳聋患者血液样本进行分析，GJB2的突变携带率为34.9%，其中235delC的突变携带率占GJB2基因突变的76.57%。235delC突变是包括中国汉族人在内的亚洲人群最常见的突变类型[13-14]。Meng等应用目标区域测序技术无创产前诊断遗传性耳聋1例，经临床分子遗传学确诊为GJB2基因复合杂合突变致聋[15]。本研究中有24例(7.55%)发生GJB2基因复合杂合突变。

SLC26A4基因又称Pendrin基因，编码蛋白质Pendrin(阴离子氯/碘)转运跨膜蛋白。该基因突变引起的耳聋已明确为常染色体隐性遗传，对于耳聋人群中非综合征性前庭导水管扩张(enlarged vestibular aqueduct,EVA)具有显著的预测意义[16]。常见突变位点为281C＞T、589G＞A、IVS7-2A＞G、1174A＞T、1226G＞A、1229C＞T、IVS15-5G＞A、1975G＞C、2027T＞A、2162C＞T、2168A＞G。

大前庭导水管(enlarged vestibular aqueduct,EVA)综合征在亚洲人群的发病与SLC26A4基因突变密切相关，在亚洲人群尤其是中国人中风险增加[17]。其中最常见的突变位点在韩国和日本为p.H723R，而在中国大陆和台湾则为IVS7-2A＞G[18]。本研究中SLC26A4突变的比例为13.4%，其中IVS7-2A＞G位点的总突变率为9.12%，纯合突变占SLC26A4突变的37.93%，杂合突变占62.07%，复合杂合突变占24.13%。这与2004年报道的284例中国人SLC26A4突变的比例为18.66%基本接近，高于欧洲人群(3.5%)。携带SLC26A4基因2条等位基因突变的患者表现为前庭水管扩大，携带SLC26A4基因单条等位基因突变的患者30%会表现为前庭水管扩大；凡是引起颅内与内耳的通道异常扩大、颅腔与内耳的通道异常扩大，以及引起颅内压变化的因素，如轻度的头部碰撞、感冒等，都能引起EVA综合征患儿听力下降。

GJB3基因编码缝隙连接蛋白31(Cx31)，其错义突变538C＞T被认为与语后高频听力下降有关[19]，常见突变位点：538C＞T、547G＞A。GJB3基因突变在中国人群中携带率低(＜3%)。本研究中，GJB3基因突变率为0.94%，均为杂合突变。

线粒体12Sr RNA的突变通过改变线粒体DNA的空间结构，形成新的与氨基糖甙类抗生素结合位点而导致对此类药物敏感而致聋。可通过母亲传给后代，后代中女性可将突变基因继续传给下一代。主要突变位点为1555A＞G[20]、1494C＞T[21]。本研究中，线粒体12Sr RNA基因突变率为3.77%，多为同质突变，仅有1例异质突变。

本研究应用四个基因20个突变位点的检测体系，发现在318例患者中，约50%患者携带耳聋致病基因。随着对耳聋基因的深入研究，将会在越来越多的先天性耳聋患者中发现遗传背景，从而更好地在其生活、婚育等方面给予指导。高通量的检测技术也将为我国大群体的耳聋患者提供更多有价值的指导。

在318例中国汉族人中，GJB2基因突变水平最高，达34.9%，235delC的突变携带率最高(25.47%)，与国内报道相关地区中国人的突变谱[22-25]基本一致。不同非综合征性耳聋人群中确定相关基因突变谱对于为先天性耳聋患者建立理想的基因筛查方法十分重要。

志谢

感谢北京益新博创生物科技公司的技术支持，以及中国残疾人艺术团、临沂市特殊教育中心、宜昌市特殊教育中心的社会支持。

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M utation Spectra of Genes in 318 Chinese Han Population w ith Nonsyndrom ic Hearing Loss

WANG Yi1,2,CHEN Lei1,2,LIU Zhi-zhong1,2,ZHANG Hai-yan3,MAJuan3
1.Beijing Bo'aiHospital,China Rehabilitation Research Center,Beijing 100068,China;2.CapitalMedicalUniversity Schoolof Rehabilitation Medicine,Beijing 100068,China;3.Bioyong Technologies Inc.,Beijing 100086,China

ObjectiveTo define themutation spectra of deafness gene in 318 Chinese Han population w ith nonsyndromic hearing loss (NSHL).MethodsFrom October,2015 to April,2016,anticoagulant venousw hole blood of 318 patients w ith NSHL w ere collected.The genes including GJB2,SLC26A4,GJB3 and 12Sr RNA were detected w ith polymerase chain reaction(PCR)and Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-FightMass Spectrometry(MALDI-TOFMS).ResultsAmong these patient,111 cases(34.9%)had GJB2mutations,in which themutation carrying rate of 235delC w as the highest(25.47%),43 cases(13.5%)had SLC26A4mutations,3 cases(0.94%) had GJB3mutations,and 12 cases(3.77%)hadmitochondria 12Sr RNAmutations.ConclusionDefinition ofmutation spectrum among differentpopulationswith NSHL is important for developmentof optimalgenetic screening services for congenitalhearing impairment.

nonsyndrom ic hearing loss;genemutation;M atrix Assisted LaserDesorption/Ionization Time-Of-FightMass Spectrometry

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.12.019

R246.81

A

1006-9771(2016)12-1451-04

2016-08-02

2016-10-02)

国家高技术研究发展计划(“863”计划)项目(No.2014AA020901)。

1.中国康复研究中心北京博爱医院，北京市100068；2.首都医科大学康复医学院，北京市100068；3.北京毅新博创生物科技有限公司，北京市100086。作者简介：王屹(1980-)，女，汉族，山西大同市人，博士，主治医师，主要研究方向：耳聋基因检测在疾病防控中的应用研究。通讯作者：刘志忠，男，博士，主任技师。E-mail:lzzlzb@126.com。