超高效液相色谱－质谱联用法检测不同品种龟甲制龟甲胶的牛皮源成分

彭婷婷，江 勋

（湖南省衡阳市食品药品检验检测中心，湖南 衡阳 421001）

超高效液相色谱－质谱联用法检测不同品种龟甲制龟甲胶的牛皮源成分

彭婷婷，江 勋

（湖南省衡阳市食品药品检验检测中心，湖南 衡阳 421001）

目的 考察不同品种的龟甲原料对龟甲胶中牛皮源成分含量的影响。方法 采用超高效液相色谱－质谱联用法（UPLC－MS），色谱柱为Zorbax C18柱（50 mm×2．1 mm，1．8 μm），以0．1%甲酸水－0．1%甲酸乙腈为流动相梯度洗脱，流速为0．3 mL／min，柱温为40℃。分别以不同品种龟甲为原料熬制龟甲胶，并对其牛皮源的含量进行测定。结果 纯草龟龟甲熬制的龟甲胶检测结果为牛皮源阴性，掺杂巴西龟龟甲的龟甲胶检测结果为牛皮源阳性。结论 该方法简便，专属性强，灵敏度高，可有效控制龟甲胶质量。

超高效液相色谱－质谱联用法；龟甲；龟甲胶；牛皮源成分

胶类药材是指由动物的皮、骨骼等加工而成的胶原蛋白，是我国特有的一类中药[1]，包括阿胶、龟甲胶、鹿角胶、黄明胶等品种。龟甲胶最早见于《本草崇源》一书，为龟甲经水煎煮、浓缩制成的固体胶[2－3]，具有滋阴、养血、止血等功效。近年来，由于生产原料来源有限，价格高昂，且现行《中国药典》标准并不能检测出龟甲胶中是否添加其他胶类成分，部分生产企业为降低成本，在龟甲胶熬制过程中掺杂价廉易得的牛皮，甚至废旧皮革以谋利，使得市面上龟甲胶质量参差不齐[4]。国家食品药品监督管理总局（CFDA）已出台了补充检验方法批准件（批件号为2014013），采用高效液相色谱－质谱联用技术对胶类药材酶解产物中的特征性多肽进行检测[5－6]，可对龟甲胶中牛皮源成分进行定性检测。但日常检测工作中发现，一些采用不同品种龟甲熬制的样品用该方法检测也呈牛皮源阳性。由于《中国药典》并未对原料中的龟甲品种有要求，为此，本研究中采用了超高效液相色谱－质谱联用（UPLC－MS）法对以巴西龟和中华草龟的龟甲为原料熬制的龟甲胶中牛皮源成分进行了定性检测。现报道如下。

1 仪器与试药

1．1 仪器

Agilent 1290－6460A型超高效液相色谱－质谱联用仪；Mettler AE240型电子分析天平；SCQ50型超声清洗机（上海申波超声公司）；XW－80A型漩涡混合器（上海医科大学仪器厂）。

1．2 试药

龟甲胶对照药材（中国食品药品检定研究院，批号为121693－201301）；黄明胶对照药材（中国食品药品检定研究院，批号为121695－201301）；序列分析级胰蛋白酶（Promega公司）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯；试验用龟甲胶样品均为实验室制得。

2 方法与结果

2．1 色谱条件与质谱条件

2．1．1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax C18柱（50 mm×2．1 mm，1．8 μm）；流动相：A为0．1%甲酸水溶液，B为0．1%甲酸－乙腈，梯度洗脱（0～7 min，5%B→20%B；7～10 min，20%B→50%B；10～10．1min，50%B→5%B；10．1～13 min，5%B）；流速：0．3 mL／min；柱温：40℃；进样量：5 μL。

2．1．2 质谱条件

Agilent 6460A QQQ质谱系统。离子化模式为ESI＋；雾化器压力为20 Psi；毛细管电压为3 kV；干燥气温度为300℃；干燥气流速为6 L／min。采用MRM采集模式：以 m／z 641．3（双电荷）→726．2（定量离子对）和m／z 641．3（双电荷）→783．3为检测离子对。

2．2 溶液制备

牛皮源成分参比溶液：取黄明胶对照药材0．1 g，置50 mL容量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液溶解并稀释至刻度，取溶液5 mL，置100 mL容量瓶中，加龟甲胶基质溶液（取龟甲胶对照药材粉末0．1 g，置50 mL容量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液溶解并稀释至刻度，即得）稀释至刻度，过0．22 μm滤膜，取续滤液50 μL，加胰蛋白酶溶液（取序列分析级胰蛋白酶，加1%碳酸氢铵溶液制成1 g／L的溶液，临用前新配）8 μL，37℃恒温酶解12 h，即得。进样测定，其色谱－质谱图见图1。

图1 超高效液相色谱－质谱图

供试品溶液：取龟甲胶样品0．1 g，置50 mL容量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液溶解并稀释至刻度，过0．22 μm滤膜，取续滤液50 μL，加胰蛋白酶溶液8 μL，37℃恒温酶解12 h，即得。

2．3 方法学考察

精密度试验：取牛皮源成分参比溶液和5号供试品溶液，进样5 μL，连续测定 6次。结果的 RSD分别为0．97%和1．01%(n＝6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取5号供试品溶液，于0，2，4，8，12，24 h分别进样5 μL。结果的 RSD为0．84%(n＝6)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取5号供试品6份，按样品测定方法试验，分别制备供试品溶液并测定。结果的 RSD为0．96%(n＝6)，表明该方法重复性良好。

2．4 样品含量测定

取5批不同原料制备的龟甲胶，依法制备供试品溶液，按拟订方法测定，结果见表1。

表1 不同原料龟甲胶样品牛皮源成分检测结果

3 讨论

中华草龟是我国的原生物种，其龟甲入药已有几千年的历史，近年来受到过度捕猎的威胁，草龟已被世界自然保护联盟列为濒危物种。巴西龟原产于美洲，属外来物种，其适应性强、食性广且生长繁殖极其迅速，目前已因其大量掠夺同类的生存资源而被列为世界最危险入侵物种之一。由于市面上草龟龟甲的售价大大超过巴西龟龟甲，且《中国药典》对熬制龟甲胶所用的龟甲原料无明确要求，一些不良厂家为了节约生产成本而大量采用价廉易得的巴西龟龟甲入药。

本试验中曾试用0．1%甲酸水溶液－乙腈为流动相进行检测，发现该流动相下对牛皮源成分的响应较低，因此改用0．1%甲酸水溶液－0．1%甲酸乙腈为流动相，以增强其响应。另考虑到不同批次的胰蛋白酶活性不一，为增强酶解效率，提高仪器响应，样品酶解量改为50 μL样品加8 μL酶溶液。

本试验中分别以草龟龟甲和巴西龟龟甲为原料，通过调整不同的龟甲比例对实验室自制的5种龟甲胶样品进行检测，发现纯草龟龟甲熬制的胶中牛皮源成分测定结果为阴性，而巴西龟龟甲胶中牛皮源成分阳性，且该方法对巴西龟龟甲检测灵敏度极高，检出限为1 g／kg。因此，该方法不仅可以对厂家违法添加牛皮的行为进行监督，同时也杜绝了厂家大量使用巴西龟龟甲代替草龟龟甲的可能，为有效控制龟甲胶质量提供了一定的参考依据。

[1]程显隆，李文杰，魏 锋，等．动物胶类药材的鉴别方法研究进展[J]．亚太传统医药，2011，7（3）：167－168．

[2]国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）[M]．北京：中国医药科技出版社，2010：169．

[3]王海波，申二永，宋汉敏，等．微波消解－电感耦合等离子体光谱法测定龟甲胶中铬的含量[J]．南京中医药大学学报，2012，28（4）：378－379．

[4]程显隆，李文杰，张小龙，等．UPLC－QTOF－MS结合主成分分析法用于龟甲胶、鹿角胶中添加牛皮源成分的检测研究[J]．药物分析杂志，2012，32（6）：931－935．

[5]张贵锋，刘 涛，王 前，等．高效液相色谱／质谱法识别不同明胶酶解产物中特征多肽[J]．分析化学研究报告，2008，36（11）：1 499－1 504．

[6]王 前，张贵锋，刘 涛，等．高效液相色谱质谱鉴别龟甲胶与鹿角胶[J]．光谱学与光谱分析，2008，28（10）：519－520．

Identification of Bovine－Hide Gelatin from Glue of Tortoise Shell M ade by Different Kinds of Tortoise Shell by UPLC－MS

Peng Tingting，Jiang Xun
（Hengyang Center of Food and Drug Control，Hengyang，Hunan，China 421001）

Objective To investigate the influence of using different kinds of tortoise shell on the content of bovine－hide gelatin from glue of tortoise shell．M ethods The UPLC－MS method was performed on the Zorbax C18column（50 mm×2．1 mm，1．8 μm），by a gradient elution using 0．1% formic acid aqueous solution－0．1% formic acid in acetonitrile as the mobile phase at a flow rate of 0．3 mL／min and at 40℃．Glue of tortoise shell were detected which were made from different kinds of tortoise shell．Results It was founded that the test results were positive which contained Trachemys scripta eleganns shell，while negative results were detected which were made by pure Chinemys reevesiis shell．Conclusion The method is simple，accucate，specific and high sensitivity which provided a basis for quality′s effective control of glue of tortoise shell．

UPLC－MS；tortoise shell；glue of tortoise shell；bovine－hide gelatin

R286．0；R282．74

A

1006－4931(2016)10－0072－02

彭婷婷（1986－），女，湖南衡阳人，硕士研究生，主要从事食品药品检验工作，（电话）0734－8800112；江勋（1981－），男，湖南衡阳人，大学本科，主管药师，主要从事食品药品检验工作，本文通讯作者，（电话）0734－8800112。

2016－01－14；

2016－02－05)