不同施肥制度对石灰性紫色水稻土中氨氧化古菌群落结构的影响

卢圣鄂,王蓥燕,陈 勇,涂仕华,张小平,辜运富,*

1 四川农业大学资源学院微生物系, 成都 611130 2 四川省农业科学院土壤肥料研究所, 成都 610066

不同施肥制度对石灰性紫色水稻土中氨氧化古菌群落结构的影响

卢圣鄂1,王蓥燕1,陈 勇1,涂仕华2,张小平1,辜运富1,*

1 四川农业大学资源学院微生物系, 成都 611130 2 四川省农业科学院土壤肥料研究所, 成都 610066

研究不同施肥制度对水稻土氨氧化古菌(AOA)群落结构和垂直分布特征的影响,可以深入认识不同施肥制度下的石灰性紫色水稻土氮素循环特征及微生物驱动机制,为该地区科学施肥、培肥地力提供理论依据。利用化学分析和变性梯度凝胶电泳(DGGE)对不同施肥制度下石灰性紫色水稻土理化性质和AOA群落结构进行了分析。结果显示：相对于无肥处理,施肥会降低石灰性紫色水稻土pH和硝氮含量,而增加土壤有机质、全氮和氨氮含量。伴随土壤深度增加,土壤pH增加,全氮和硝氮含量降低,氨氮含量变化趋势不明显。不同施肥制度在不同土壤深度对石灰性紫色水稻土AOA群落结构产生不同的胁迫效应,不同施肥制度下的AOA群落结构在0—20 cm处差异不明显；土壤深度增加,不同施肥制度下的AOA群落结构表现出明显差异,CK和N肥处理下的AOA群落结构较简单。AOA群落结构多样性指数和丰富度随土壤深度增加而减小。石灰性紫色水稻土AOA与来自不同土壤和水体环境的AOA具有明显相似性。冗余梯度分析(RDA)显示pH(P=0.012)是造成石灰性紫色水稻土AOA群落结构差异的主要原因。研究揭示石灰性紫色水稻土中的AOA群落结构受施肥制度明显影响并表现出明显的垂直分布特征。

长期定位施肥；石灰性紫色水稻土；DGGE；AOA群落结构

AOA是农田生态系统硝化过程的主要驱动者且受到农业管理措施的明显胁迫,施肥制度、土壤pH和土壤类型是影响AOA群落结构的重要因子[5- 7]。长期定位施肥会对土壤中的硝化作用和氨氧化微生物的种群结构及丰度等形成明显影响[8- 9]。土壤pH因直接影响土壤中氨态氮的有效性而影响氨氧化微生物的种群结构、数量和丰度等特征[6]。研究表明,在中性和碱性土壤上施用高量氮肥会显著改变AOB的群落组成和丰度,而对AOA的影响有限[10- 12]。但在酸性土壤上的研究结论却与之相反,长期施肥会显著影响AOA群落结构特征[13- 15]。综上,土壤类型不一样,不同施肥制度对土壤氨氧化微生物的影响也不尽一致,受施肥制度影响下的土壤AOA的垂直分布变化特征也尚不清楚。

石灰性紫色水稻土是四川乃至全国广泛分布的一种重要农业土壤,面积约4.00×106hm2[16]。该类土壤土质较疏松,有机质含量较低,氮、磷低,土体浅薄,保水抗旱能力差。为保护石灰性紫色水稻土质量,规范施肥管理措施,四川省于20世纪80年代在该类土壤上建立了“NPK长期肥效试验”。本文探索了石灰性紫色水稻土AOA群落结构对不同施肥制度的响应特征和垂直分布变化,以期为认识不同施肥制度下石灰性紫色水稻土的氮素循环特征及微生物驱动机制,保护石灰性紫色水稻土质量提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验设计

长期定位实验点位于四川遂宁市船山区联盟乡二村五组(30°10′50′′N,105°03′26′′E),气候为亚热带季风气候,全年气候温和,雨量充沛。土壤为原生钙质紫色土属,遂宁组母质,二泥田土种。试验始于1982年,完全随机区组设计,共8个处理：(1)不施肥(CK)；(2)氮肥(N)；(3)氮磷肥(NP)；(4)氮磷钾肥(NPK)；(5)农家肥(M：主成分为猪厩肥,有机质含量1.5 mg/kg)；(6)氮肥+农家肥(NM)；(7)氮磷肥+农家肥(NPM)；(8)氮磷钾肥+农家肥(NPKM)。肥料施用量：氮肥(N)55.2 kg/hm2；钾肥(KCl)31.5 kg/hm2；磷肥(P2O5)13.2 kg/hm2；农家肥3×104kg/hm2,等氮量设计。实验开始时土壤的养分情况为：pH 8.6,有机质15.9 g/kg,全氮0.109%,碱解氮66.3 mg/kg,全钾2.689%,有效钾130.6 mg/kg,缓效钾699.4 mg/kg,全磷0.135%,有效磷3.9 mg/kg。

1.2 土样采集与预处理

于2013年7月1日水稻淹水种植期间,在小区内按“梅花型”布点取样,用土钻分别钻取0—20 cm(L1),20—40 cm(L2),40—60 cm(L3)和60—90 cm(L4)深的土样,分层混匀,用无菌PET树脂袋封装放于冰盒中带回实验室。取混合均匀的新鲜土样立即提取土壤总DNA,另取部分土样于室温下风干后进行土壤理化性质测定,剩余土样于-20 ℃保存备用。

1.3 土壤基本理化性质测定

测定方法参照鲁如坤土壤农业化学分析方法[17]。

1.4 土壤AOA群落结构的PCR-DGGE分析

1.4.1 土壤微生物总DNA提取

采用Fast DNA Spin Kit for Soil(Qbiogene, Carlsbad, CA, USA)的试剂盒方法,称取0.5 g新鲜土壤样品,重复3次,按试剂盒上的步骤进行土壤微生物总DNA的提取。

1.4.2 amoA基因的PCR扩增

PCR引物CrenamoA- 23f的序列：5′-ATGGTCTGGCTWAGACG- 3′,引物CrenamoA- 616r的序列：5′-GCCATCCATCTGTATGTCCA- 3′[18]。反应体系：PCR Master Mix(TIANGEN BIOTECH. BEIJING)25 μL,每种引物0.5 μL(25 pmol/μL,10 ng土壤总DNA,加ddH2O至终体积50 μL。反应程序：预变性95 ℃ 5 min,变性95 ℃ 30 s,退火温度52 ℃ 30 s,延伸温度72 ℃ 45 s,共进行32个循环,72 ℃ 10 min,最后于4 ℃恒温保存。取PCR产物各2 μL,1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像系统(Gel Doc Documentation System, Bio-Rad, USA)下观察。

1.4.3 DGGE分析

取PCR产物15 μL进行DGGE分析,变性剂梯度为30%—60%,聚丙烯酰胺凝胶浓度8%(100%的变性剂为尿素7 mol和40%的去离子甲酰胺)。在1×TAE缓冲液中,50 V 30 min进胶,再在150 V 60 ℃下电泳5 h,电泳后用硝酸银[19]对凝胶进行染色,然后用数码相机拍照。利用凝胶成像系统(Gel Doc Documentation System, Bio-Rad, USA)中自带的Quantity One 4.4软件对DGGE图谱进行分析。

1.5 DGGE条带的克隆及测序

PCR产物用Clean-UpTM试剂盒(MO BIO Labs, Solana Beach, CA, USA)进行纯化,纯化后的PCR产物与pGEM-T Vector进行连接,利用E.coliDH5α感受态细胞进行转化,用氨苄青霉素(100 mg/L)抗性和PCR进行检测,采用蓝白斑筛选阳性克隆子,送上海生物工程技术有限公司进行测序。

1.6 数据处理

基础数据的处理利用Excel 2007进行,Duncan单因素方差分析用SPSS 17.0完成。DGGE图谱利用Bio-Rad公司的Quantity One 4.4分析。用MEGA 6.0构建AOAamoA基因系统发育树。用Shannon多样性指数(H),丰富度(S)和均匀度(EH)等评价AOA群落结构多样性。采用CANOCO 4.5.1软件(Microcomputer Power,Ithaca,USA)分析AOA群落结构和土壤理化因子间的关系。多样性指数计算公式为：H=-∑(ni/N)ln(ni/N),EH=H/lnS,式中ni为单一条带的强度,N为所有条带的总强度,S为每一泳道总的条带数。

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质

不同施肥制度对石灰性紫色水稻土理化性质产生明显影响(表1)。相对于无肥处理(pH=7.53),农家肥配施无机肥处理下的土壤pH介于7.24—7.41之间,显示施肥会降低土壤pH。就不同土壤深度而言,0—20 cm土壤的pH低于其它深度。无机肥处理下的土壤有机质含量介于1.44%—3.85%之间,农家肥与无机肥配施下的土壤有机质介于1.91%—3.28%之间,而CK处理下的有机质含量为1.7%。而农家肥与化肥配施会增加土壤总氮含量。就不同深度而言,0—20 cm土壤的总氮含量高于其它深度。农家肥配施化肥会降低土壤硝氮含量,总体上,0—20 cm土壤的硝态氮含量高于其它层次。相对于无肥和化肥处理,配施农家肥的4种施肥处理(M,NM,NPM,NPKM)下的氨态氮变化比较平稳。施肥会增加表层土(0—20 cm)中的氨态氮含量,不同深度土壤的氨态氮含量变化趋势不明显。

表1 不同施肥制度下部分土壤理化性质随采样深度的变化

SOM：土壤有机质 Soil organic matter；TN：全氮 Total nitrogen；CK：对照；N：氮肥 Nitrogen；NP：氮磷肥 Nitrogen and phosphorus；NPK：氮磷钾肥 Nitrogen;phosphorus and potassium；M：农家肥 Manure；NM：氮肥+农家肥 Nitrogen+manure；NPM：氮磷肥+农家肥 Nitrogen and phosphorus+ manure；NPKM：氮磷钾肥+农家肥 Nitrogen;phosphorus and potassium+ manure

2.2 不同施肥制度土壤AOA的群落结构分析

2.2.1 AOA DGGE图谱分析

不同施肥处理土壤AOA群落结构的DGGE图谱见图1。不同施肥处理土壤AOA的DGGE图谱在电泳条带数量、强弱和位置均存在一定程度的差异,显示不同施肥制度影响了石灰性紫色水稻土的AOA群落结构。图中共同的条带(a、b、c和d箭头所示),说明供试土壤在不同采样深度存在共有的AOA类群,但其亮度不同,表明长期不同施肥处理AOA在DNA水平上有改变。不同深度土壤AOA种群结构表现出明显差异。在0—20 cm处,不同施肥制度下土壤AOA种群结构变化不明显。土壤深度增加,AOA丰富度减小,AOA群落结构表现出差异。在20—40 cm处,N处理下AOA群落结构最简单,NPK和NPKM肥料处理下的AOA群落结构最复杂；在40—60 cm深度,N处理的AOA群落结构最简单, CK其次,而氮肥配施农家肥处理下的AOA最复杂；在60—90 cm深度,CK处理下的AOA群落结构最简单,NP处理下的AOA群落结构最复杂。

2.2.2 AOA群落结构多样性分析

不同施肥制度下不同深度土壤AOA多样性指数(H)、丰富度(S)、均匀度(EH)存在显著差异(P<0.05)(表2)。在0—20 cm处,不同施肥制度下土壤AOA群落结构多样性和丰富度变化不明显。伴随着土壤深度的增加,AOA多样性和丰富度减小。在20—40 cm处,N肥处理下AOA多样性指数和丰富度最低,NPKM肥料处理下的AOA多样性指数和丰富度最高；40—60 cm处也是N肥处理下土壤AOA多样性指数和丰富度最低,CK其次,NM肥处理下的AOA最高；在60—90 cm深度, CK处理下的AOA多样性指数和丰富度最低, NP处理下的AOA最高。

图1 石灰性紫色水稻土AOA 的DGGE图谱分析Fig.1 DGGE profile of AOA communities of the Calcareous Purple Paddy soilL1：0—20cm深度,L2：20—40 cm深度,L3：40—60 cm深度,L4：60—90 cm深度;施肥处理从左到右依次为无肥(CK)；氮肥(N)；氮磷肥(NP)；氮磷钾肥(NPK)；农家肥(M)；氮肥加农家肥(NM)；氮磷肥加农家肥(NPM)；氮磷钾肥加农家肥(NPKM);字母a、b、c、d表示各处理间的共同条带；其中L1- 1- 2等编号表示切胶回收条带

施肥处理FertilizertreatmentsShannon多样性指数Shannon′sdiversityindex(H)均匀度Evenness(EH)丰富度Richness(S)L1L2L3L4L1L2L3L4L1L2L3L4CK2．38c2．40c1．88e1．78e0．992a0．937d0．967cd0．916f12c11c7c6dN2．54ab2．23b1．68f2．25ab0．991ab0．870e0．949c0．939d13bc10d7c7cNP2．61a2．46c2．25c2．47a0．991ab0．988b0．984a0．978a15a13a10bc11aNPK2．46b2．58a2．16d2．17cd0．988b0．979bc0．956d0．942cd14b13a10bc9bM2．46b2．40c2．40b2．21a0．991ab1．004b0．955e0．921e14b12b11b10abNM2．46b2．40c2．43a2．06d0．986b0．866f0．975bc0．939d15a12b11b9bNPM2．36d2．49bc2．35c2．18c0．988b0．946c0．976b0．945c14b12b12a10abNPKM2．36d2．54b2．37bc2．24b0．985c1．024a0．973c0．966b13bc13a11b10ab

数字后具相同字母表示差异不显著,数字后具不同字母表示差异显著(Duncan 新复极差法测验P=0.05)

2.2.3 AOA系统发育分析

对石灰性紫色水稻土中优势AOA序列和GenBank数据库中的相关序列比对后利用MEGA 6.0进行系统发育分析(图2),结果将16条序列主要分成2个群。第1个群与来源于底泥和土壤中的氨氧化古细菌amoA基因相似,分为3个簇；第2个群与底泥和水体样品相关,分为1个簇,并与已知氨氧化古菌CandidatusNitrososphaeragargensis(GI：EU281321)聚在一起。与该类土中AOA亲缘关系较近的已知基因序列既有来自土壤的,又有来自沉积物和水体的。在16条DGGE图谱切胶回收条带中,KP400767,KP400765与长江河口沉积物古菌序列KC735504聚在一起；KP400756,KP400753和崇明东部潮滩沉积物古菌序列JQ345856聚在一起；KP400760,KP400766与淹水稻田土古菌序列KJ908047聚在一起；KP400768,KP400757与高原湖泊沉积物古菌序列KJ005035聚在一起；KP400764,KP400761与淹水稻田土古菌序列KJ907957聚在一起；KP400758,KP400763分别与高海拔湿地沉积物古菌序列KJ645381,水稻土古菌序列KJ542817聚在一起；KP400762,KP400755分别与大运河古菌序列KF537053、长江河口古菌序列KC735430聚在一起；系统发育结果显示石灰性紫色水稻土AOA群落结构较复杂。石灰性紫色水稻土中的氨氧化古细菌均属于奇古菌门,与已知氨氧化古菌CandidatusNitrososphaeragargensis(GI：EU281321)相似。

图2 石灰性紫色水稻土中AOA amoA基因的系统发育树(加粗的编号为本实验所得序列)Fig.2 Phylogentic tree of the archaea amoA gene sequences retrieved from the Calcareous Purple Paddy soil amended with different fertilization systems, the bold codes refers the sequences obtained in this study

2.3 AOA群落结构与环境参数的相关性分析

图3 氨氧化古菌群落与环境因子变化的RDA排序图 Fig.3 RDA ordination diagram of ammonia oxidation archaea communities associated with environmental variable图中数字为土样编号;1—8采自L1深度,对应施肥处理分别为：CK, N, NP, NPK, M, NM, NPM, NPKM；编号9—16采自L2深度,数字由小到大分别对应L1中1—8对应的施肥处理；17—24为L3深度,数字由小到大分别对应L1中1—8对应的施肥处理；25—32为L4深度样品,数字由小到大分别对应L1中1—8对应的施肥处理

3 讨论

3.1 不同施肥处理对AOA群落结构的影响

农业管理措施是影响土壤中各种微生物活动、群落结构等的重要因素,如翻耕、灌溉、施肥等因素都会影响到土壤中各种微生物的多样性[22]。实验结果表明,在0—20 cm处,不同施肥制度下土壤AOA群落结构变化不明显。土壤深度增加,AOA丰富度减小,群落结构出现差异。在20—40 cm处,N肥处理下AOA多样性指数和丰富度最低,NPKM肥料处理下的AOA多样性指数和丰富度最高；40—60 cm深度,寡氮处理下AOA多样性指数和丰富度最低,CK其次,而NM处理下的AOA最高；在60—90 cm深度,CK处理AOA多样性指数和丰富度最低,NP处理下的最高。Shen等[11]研究表明,在中性和碱性土壤上施用高量氮肥会显著改变AOB的群落组成和丰富度,而对AOA的影响有限。但在酸性土上的研究结论却与之相反,Wu等[12]研究证实长期施肥会显著影响AOA群落结构特征,且AOA比AOB在硝化作用中起更重要的作用[23]。本文通过研究长期定位施肥对石灰性紫色水稻土AOA群落结构的影响,显示不同施肥制度下的土壤AOA种群结构在0—20 cm变化不明显,这与前人的研究结果一致[11,24]。总体而言,石灰性紫色水稻土表层土壤AOA群落结构对不同施肥制度响应不明显；土壤深度增加,不同施肥制度下AOA群落结构和丰富度表现出差异。

3.2 不同土壤深度对AOA群落结构的影响

土壤是一个复杂的异质体系,土壤奇古菌分布不仅与土壤养分状况紧密相关,也与不同土壤深度理化性质的相互作用有很大的关系[25- 26]。本试验显示石灰性紫色水稻土L1、L2深度中的AOA群落丰富度S高于L3、L4深度,其中L1深度AOA丰富度S最高。可能是因为水稻淹水时土壤处于厌氧状态,而水稻根系能够分泌O2,为水稻根层提供充足的氧,来支持非专一性的好氧反应。另有研究表明,奇古菌门(Thaumarchaeota)硝化球菌属的AOA更偏好根际的生长环境[27]。且土壤表层养分更充足,AOA可用来为自己提供能量的底物更多。向燕等[28]研究表明太湖沉积物中AOA群落结构垂直分布变化不明显。但梁龙等[29]等的研究却发现AOA的数量在百花湖沉积物中存在比较明显的分层现象,其中深层沉积物(22—30 cm)中的AOA数量是浅层沉积物(1—21 cm)的2倍左右。上述研究反映出,AOA群落结构在环境样品垂直方向上的变化会受到样品特性的显著影响。而石灰性紫色水稻土中的AOA群落结构表现出明显的垂直减少特征,分析原因可能是不同土壤深度的养分状况、通气性等理化性质有较明显差异,会选择性胁迫氨氧化古菌群落的演化,从而导致氨氧化古菌对不同土壤深度产生特异的生态适应[30-32]。

3.3 土壤环境参数对AOA群落的影响

4 结论

本文显示不同深度石灰性紫色水稻土中AOA受不同施肥制度影响各不相同,土壤深度增加,施肥对土壤AOA群落结构的影响愈加明显。石灰性紫色水稻土中的AOA均属于奇古菌门(Thaumarchaeota),与已知氨氧化古菌CandidatusNitrososphaeragargensis(GI：EU281321)相似。pH是影响石灰性紫色水稻土AOA群落结构的重要因子。

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Impact of different long-term fertilization systems on ammonia oxidation Archaea community structures in Calcareous Purple Paddy soil

LU Sheng′e1, WANG Yingyan1, CHEN Yong1, TU Shihua2, ZHANG Xiaoping1, GU Yunfu1,*

1DepartmentofMicrobiology,CollegeofResource,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China2SoilandFertilizerInstitute,SichuanAcademyofAgriculturalSciences,Chengdu610066,China

Increasing evidence revealed that ammonia oxidation Archaea (AOA) belonging toThaumarchaeotacould control nitrification in various agricultural ecosystems. Studying the impact of different long-term fertilization systems on the shift of the AOA community structure and vertical distribution would contribute to understanding the soil nutrient biogeochemical cycles and microbial drive mechanisms. In the present study, an “N, P, K long-term fertilization field experiment (1982—2014)” was established in a Calcareous Purple Paddy soil in Suining City, Sichuan Province of the PR China. Eight treatments including three chemical fertilizer (CF) treatments (N, NP, and NPK), three CF plus farmyard manure (M) treatments (NM, NPM, and NPKM), M only, and no fertilizer (CK) as control were used. Soil samples amended with different long-term fertilization systems at four different depths (0—20, 20—40, 40—60, 60—90 cm) were collected; the soil physico-chemical parameters and the shift of the AOA community structure and vertical distribution were analyzed by chemical analysis and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). The results showed that compared to the no fertilizer treatment (CK), soil pH decreased under the CF treatments, and showed little variation under CFM treatments. The pH values in the 0—20 cm soil depth were lower than those in other soil depths. The combined use of farmyard manure and chemical fertilizer could also improve the soil total nitrogen concentration. The total nitrogen content in 0—20 cm soil depth was also higher than that of other depths. Fertilizer increased the soil ammonia content in the 0—20 cm soil depth, and in this soil depth, the CK treatment had the lowest ammonia concentration. Furthermore, soil ammonia concentrations under the four CFM fertilizer treatments (e.g. M, NM, NPM, and NPKM) were similar. Additionally, chemical fertilizer plus farmyard manure decreased the soil nitrate concentration, and the nitrate concentration in the 0—20 cm soil depth was higher than that of other depths. Based on the DGGE analysis, different fertilization systems affected the AOA community structure in different soil depths differently. The AOA community structure in the 0—20 cm depth with different fertilizer amendments showed minor variation. With increasing soil depth, the AOA community structure with different fertilization systems varied significantly. The AOA community structure in the CK and N fertilized soil were much simpler than those under CF and CFM fertilizer treatments. However, the AOA community structure showed significant vertical variation, both the richness and Shannon-Wiener diversity index in the 0—20 cm soil depth were the highest, while those in the 60—90 cm soil depth were the lowest. According to the sequence and phylogeny analysis, AOA in Calcareous Purple Paddy soil were all affiliated toThaumarchaeota, and they were highly similar to the AOA in different soil and water environments. According to the redundancy gradient analysis (RDA), four soil physico-chemical parameters such as pH, total nitrogen, ammonia, and nitrate concentration showed 11.3, 2.8, 1.8, and 1% contributions to the AOA community structure, respectively. Soil pH (P= 0.012) was the critical factor to shape the AOA community structure in Calcareous Purple Paddy soil. The study revealed that AOA in the Calcareous Purple Paddy soil responded to the fertilization systems variously, and showed an obvious vertical distribution.

long-term fertilization; calcareous purple paddy soil; DGGE; AOA community structure

国家自然科学基金项目(41201256)；四川省自然科学基金项目(SC200902158)；四川农业大学“双支计划”项目(01470702)

2015- 04- 14;

日期:2016- 03- 03

10.5846/stxb201504140752

*通讯作者Corresponding author.E-mail: guyf@sicau.edu.cn

卢圣鄂,王蓥燕,陈勇,涂仕华,张小平,辜运富.不同施肥制度对石灰性紫色水稻土中氨氧化古菌群落结构的影响.生态学报,2016,36(21):6919- 6927.

Lu S E, Wang Y Y, Chen Y, Tu S H, Zhang X P, Gu Y F.Impact of different long-term fertilization systems on ammonia oxidation Archaea community structures in Calcareous Purple Paddy soil.Acta Ecologica Sinica,2016,36(21):6919- 6927.