抗原致敏IL-27基因修饰的树突状细胞活化的CTL对食管癌细胞线粒体膜电位及凋亡的影响

王少青，张晚鱼，王大鹏,王世东,米 源,王 雷*

(1.河北省隆尧县医院胸外科，河北 隆尧 055350；2.河北省涉县医院病理科，河北 涉县 056400;3.冀中能源峰峰集团有限公司总医院外科，河北 邯郸 056201；4.冀中能源峰峰集团有限公司总医院皮肤性病科,河北 邯郸 056201；5.河北医科大学第四医院胸外科，河北 石家庄 050011)



·论 著·

抗原致敏IL-27基因修饰的树突状细胞活化的CTL对食管癌细胞线粒体膜电位及凋亡的影响

王少青1，张晚鱼2，王大鹏3,王世东4,米 源5,王 雷5*

(1.河北省隆尧县医院胸外科，河北 隆尧 055350；2.河北省涉县医院病理科，河北 涉县 056400;3.冀中能源峰峰集团有限公司总医院外科，河北 邯郸 056201；4.冀中能源峰峰集团有限公司总医院皮肤性病科,河北 邯郸 056201；5.河北医科大学第四医院胸外科，河北 石家庄 050011)

目的研究IL-27基因转染的树突状细胞(dendritic cell，DC)活化CTL体内诱导食管癌细胞凋亡的影响。方法通过在裸鼠的移植瘤周注射食管癌细胞抗原致敏、IL-27基因修饰DC(DCIL-27+Ag)活化的特异CTL，采用流式细胞术检测细胞凋亡水平，荧光染料罗丹明123染色检测细胞线粒体膜电位水平并检测caspase-3蛋白表达水平。结果5组之间凋亡率、膜电位水平、caspase-3表达差异均有统计学意义(P<0.05)：DCIL-27+Ag、DCIL-27、DCnaive、Tnaive组凋亡率、caspase-3表达均高于PBS组，膜电位水平低于PBS组；DCIL-27+Ag、DCIL-27、DCnaive组凋亡率、caspase-3表达均高于Tnaive组，膜电位水平低于Tnaive组；DCIL-27+Ag、DCIL-27组凋亡率、caspase-3表达均高于DCnaive组，膜电位水平低于DCnaive组；DCIL-27+Ag组凋亡率、caspase-3表达均高于DCIL-27组，膜电位水平低于DCIL-27组。结论在荷瘤小鼠体内，经食管癌细胞抗原致敏、IL-27基因修饰的DC可活化特异性CTL产生较强的细胞毒作用，其机制可能是CTL通过降低食管癌细胞线粒体膜电位，启动内源性线粒体凋亡途径，激活caspase-3蛋白，从而诱导细胞凋亡。

食管肿瘤；树突状细胞；白细胞介素27；细胞凋亡

食管癌是最常见的上消化道恶性肿瘤之一，每年其发病率在全球范围居恶性肿瘤第8位，约有45.6万新发病例；病死率在全球范围居恶性肿瘤第6位，每年近40 万死亡病例，其中我国食管癌的发病率和病死率约占世界的 50%[1-3]。中晚期食管癌患者即使经过手术和放化疗等传统治疗，仍易于复发转移，其中免疫缺陷被认为是食管癌复发和转移的关键因素之一。最近的资料显示过继免疫治疗可以改善晚期肿瘤患者的免疫抑制状态，是一种具有较高安全性和有效的治疗方法[4-6]。树突状细胞(dendritic cell，DC)是体内最有效的抗原提呈细胞，在诱导机体免疫应答及特异性抗肿瘤免疫中发挥重要作用。荷瘤宿主体内的DC异常是导致肿瘤细胞免疫逃逸的重要方面，这使其不能有效提呈肿瘤抗原和提供协同刺激信号，从而不能细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)进行有效激活而导致肿瘤发生发展。目前，以DC 为基础的肿瘤免疫治疗及DC 疫苗等方面已取得较大进展[7-8]。白细胞介素27(interleukin 27，IL-27)是IL-6/IL-12家族细胞因子,主要来源于活化的单核巨噬细胞和DC。IL-27具有促进CTL产生和活化，增强CTL细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。此外，IL-27可以抑制肿瘤新生血管生成而起到抗肿瘤作用[9-11]。本研究探讨IL-27基因修饰的DC诱导食管癌细胞凋亡的机制，旨在为食管癌的生物治疗提供一个新思路。

1 材料与方法

1.1细胞株与动物 PA317/IL-27由河北医科大学第四医院科研处提供。Eca109食管癌鳞癌细胞株由河北医科大学第四医院科研中心保存。 BALB/C(nu/nu)裸小鼠购自南京斯科瑞生物科技有限公司(合格证号：0158144)，3～4周龄，体质量16～18 g，雌雄各半，于无特定病原体环境喂养。

1.2试剂和仪器 淋巴细胞无血清培养基(GT-T551)购自上海联逊生物科技有限公司；RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Gemini公司；胰蛋白酶购自北京索莱宝公司；Polybrene购自美国Sigma公司；罗丹尼123(Rhodanmine123，Rho123)购自中国Solarbio公司；碘化丙啶(PI)购自美国Sigma 公司；rhGM-CSF、 rhIL-4、rhIL-2购自美国Peprotech公司；PBS购自日本TAKARA公司；鼠抗人caspase-3单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；无菌培养板购自美国Costar公司；流式细胞仪(Epic-XLⅡ型)购自美国Beckmen Coulter公司。

1.3制备人食管癌细胞裸鼠移植瘤模型 Eca109细胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(青、链霉素各100 U/mL)，37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养传代，将呈对数生长期的Eca109细胞制成单细胞悬液，每只于裸鼠右侧背部皮下接种1×107细胞，成瘤标准为皮下结节直径超过0.5 cm，成瘤率100%。

1.4DC的转染和致敏 用淋巴细胞分离液分离食管癌患者的外周血，1 000 r/min离心30 min；吸取单个核细胞层进行细胞培养，单个核细胞贴壁2 h后吸取的悬浮细胞即是淋巴细胞，应用尼龙毛柱分离纯化的自体T淋巴细胞(效应细胞)用于混合淋巴细胞反应研究。将单个核细胞培养的贴壁细胞隔天加rhIL-4(50 μg/L)，rhGM-CSF(100 μg/L) 5%CO2，37 ℃培养，获得的细胞为DC。第6天将DC分组：DCIL-27+Ag组，抗原致敏IL-27基因修饰DC；DCIL-27组，IL-27基因修饰DC；DCnaive组，未转染DC组。分别加PA317/IL-27培养上清、polybrene于DCIL-27+Ag组和DCIL-27组，转染4 h后收集DC继续培养。其中DCIL-27+Ag组加入Eca109细胞冻融抗原悬液后致敏DC 72 h。

1.5人食管癌细胞裸鼠移植瘤模型的实验分组、治疗和观察、组织取材 将移植瘤裸鼠模型按照雌雄各半每组8只的原则随机分成5组。将DC、DCIL-27和DCIL-27+Ag细胞浓度调节为2×107/mL后按1∶1比例与Tnaive细胞均匀混合。第1组作为对照于瘤体周围注射PBS；第2组于瘤体周围注射Tnaive；第3组于瘤体周围注射DC +Tnaivel；第4组于瘤体周围注射DCIL-27+Tnaive；第5组瘤体周围注射DCIL-27+Ag+Tnaive，每4 d注射1次，每组每次均注射0.2 mL，共注射 5次，于注射完毕后1周处死裸鼠，切取肿瘤。

1.6流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡、线粒体膜电位及caspase-3蛋白表达变化

1.6.1流式细胞术检测移植瘤组织细胞凋亡率 网挫法将每组移植瘤样本制备成单细胞悬液，取单细胞悬液100 μL(含1×106个细胞)加入碘化丙啶1mL，在4 ℃冰箱中染色30 min后应用流式细胞仪检测凋亡。对细胞凋亡应用Expo 32 ADC软件进行分析。

1.6.2流式细胞术检测移植瘤组织细胞线粒体膜电位 网挫法将每组移植瘤样本制备成单细胞悬液并调整细胞数为1×106/mL，用冷PBS洗涤细胞，加入Rho 123染料并调整Rho 123浓度为10 mg/L，在37 ℃避光30 min，PBS洗涤细胞，上机检测每组样品的线粒体膜电位水平，用平均荧光强度表示线粒体膜电位水平。

1.6.3流式细胞术检测移植瘤组织的caspase-3蛋白表达 网挫法将每组移植瘤样本制备成单细胞悬液，调整每组样品的细胞数为1×106/mL，用PBS洗涤细胞，100 μL PBS液悬浮细胞后每组样本分别加入鼠抗人caspase-3抗体100 μL，室温避光静置30 min，PBS洗涤细胞，加入羊抗鼠FITC-IgG二抗工作液室温避光孵育30 min，PBS 10 mL常规离心后弃上清，加入PBS 1 mL悬浮细胞，再经300目尼龙网过滤，然后上机检测caspase-3蛋白量。用平均荧光强度表示蛋白的表达量。每组实验重复3次。

1.7统计学方法 应用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料比较分别采用单因素方差分析和q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

5组之间凋亡率、膜电位水平、caspase-3表达差异均有统计学意义(P<0.05)。DCIL-27+Ag、DCIL-27、DCnaive、Tnaive组凋亡率、caspase-3表达均高于PBS组，膜电位水平低于PBS组；DCIL-27+Ag、DCIL-27、DCnaive组凋亡率、caspase-3表达均高于Tnaive组，膜电位水平低于Tnaive组；DCIL-27+Ag、DCIL-27组凋亡率、caspase-3表达均高于DCnaive组，膜电位水平低于DCnaive组；DCIL-27+Ag组在凋亡率、caspase-3表达均高于DCIL-27组，膜电位水平低于DCIL-27组。见表1，图1。

表1 不同组别CTL细胞对细胞凋亡和细胞线粒体膜电位水平的影响Table 1 Effect of different DCs induce CTL producing on the tumor cells apoptosis rate，mitochondrial transmembrane potential and caspase-3 protein protein

图1 DC活化的CTL对裸鼠人食管癌移植瘤细胞凋亡的影响A.PBS组;B.Tnaive组;C.DCnaive组;D.DCIL-27组;E.DCIL-27+Ag组Figure 1 Effect of different DCs induce CTL producing on the tumor cells apoptosis

3 讨 论

晚期食管癌患者不但承受巨大肿瘤负荷，而且接受放、化疗等综合治疗，不可避免地具有明显的不良反应，呈现出免疫抑制状态，造成肿瘤细胞的免疫逃逸，导致患者预后差。过继性细胞免疫治疗可以通过注射免疫活性细胞激发机体免疫功能，增强机体微环境的抗肿瘤能力，逆转患者的免疫抑制状态，最终改善疾病缓解率和延长生存期[12]。DC与肿瘤的发生、发展及预后均有一定的关系，DC功能缺陷或DC数量减少导致肿瘤免疫逃逸，使肿瘤得以发生、发展，活化的DC能将肿瘤抗原提呈给T细胞，是抗肿瘤，免疫的启动者。有研究表明DC能激活特异肿瘤相关T淋巴细胞抗肿瘤，并且能直接对肿瘤细胞有细胞毒作用[13]。

IL-27作为一种具有多种生物学活性的免疫调节因子可作用于免疫系统发挥广泛的免疫调节作用[14]。IL-27可以通过促进细胞毒性T细胞的产生和活化来增强抗肿瘤免疫。Kachroo等[15]研究显示，在非小细胞癌中IL-27通过STAT1抑制上皮-间质转化和肿瘤血管生成的作用进而抑制肿瘤的发生发展。此外，IL-27可以体外抑制前列腺癌细胞增殖，体内抑瘤实验可以显著抑制肿瘤生长和微血管形成[16]。笔者在前期研究中发现食管癌组织及引流淋巴结中DC存在着功能缺失。IL-27 基因修饰可以增强DC在体外诱导产生特异性T淋巴细胞达到抗食管癌作用，其机制可能与IL-27可以活化 T 淋巴细胞，致使 CTL分泌IFN-γ 的能力增强有关[17-18]。本研究通过体内实验进一步探讨IL-27 基因修饰DC后诱导产生的CTL细胞抗肿瘤的机制。

细胞凋亡是由多种基因参与调控的细胞主动的程序性细胞死亡，主要包括线粒体途径、死亡受体途径和内质网途径等三大途径，其中线粒体途径属于内源性凋亡途径，其特征是线粒体内跨膜电位降低和耗散可以导致细胞色素C等释放以及活化caspase家族蛋白酶，发生一系列的caspases级联放大反应[19]。 Caspase家族蛋白酶作为凋亡过程中的效应蛋白，其活化程度和表达情况与凋亡密切相关，caspase-3作为整个凋亡级联反应的核心蛋白，可以通过裂解细胞内某些重要底物蛋白，在线粒体凋亡途径的凋亡执行期中发挥关键性的枢纽作用。Caspase-3表达降低可导致细胞凋亡停止并引起肿瘤的发生和发展[20-21]。Liu等[22]研究发现活化的caspase-3可以通过Bax依赖的线粒体途径诱导结肠癌细胞凋亡。本研究结果显示，DCIL-27+Ag组的肿瘤组织内细胞线粒体膜电位出现显著降低，caspase-3蛋白表达水平呈现显著增加。分析其机制可能是DCIL-27+Ag激活的CTL在体内可以通过降低细胞的线粒体膜电位水平和激发caspase级联反应进而活化caspase-3蛋白表达，起到促进肿瘤细胞凋亡的作用，在体内体现出较强的特异性细胞毒作用，

综上所述，经食管癌细胞抗原致敏、IL-27基因修饰的DC可活化特异性CTL，其诱导凋亡的机制可能与肿瘤细胞膜电位水平和caspase-3有关，本研究为IL-27临床上应用于食管肿瘤的生物治疗提供了一个新思路。

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(本文编辑：刘斯静)

Effects of specific CTL which are activated by DC modified with IL-27 gene and esophageal tumor lysate on esophageal carcinoma cell mitochondria membrane potential and cell apoptosis

WANG Shao-qing1, ZHANG Wan-yu2, WANG Da-peng3, WANG Shi-dong4, MI Yuan5, WANG Lei5*

(1.Department of Chest Surgery， the Hospital of Longyao County, Hebei Province Longyao 055350, China; 2.Department of Pathology, Shexian Hospital of Hebei Province, Shexian 056400, China; 3.Department of Surgery, General Hospital of Fengfeng to Jizhong Energy Group, Handan 056201, China; 4.Department of Dermatology, General Hospital of Fengfeng to Jizhong Energy Group,Hebei Province Handan 056201, China; 5.Department of Thoracic Surgery, Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011, China)

ObjectiveTo explore the effect of specific cytotoxic lymphocyte(CTL) which are activated by dendritic cell(DC) modified with IL-27 gene and esophageal tumor lysate on esophageal carcinoma cell apoptosis.MethodsAfter making the nude mice models with esophageal cancer cell successfully, the mice were immunized with specific CTL which are activated by IL-27 gene modified DC loaded with esophageal tumor lysate(DCIL-27+Ag). The cell apoptosis rate was analyzed by Annexin V/PI staining. The mitochondrial membrane potential was measured by Rhodamine 123 staining and the expression level of caspase-3 protein was detected by flow cytometry.ResultsThe ratio of apoptosis, membrane potential of mitochondria and expression of caspase-3 of 5 groups showed significant difference(P<0.05).The ratio of apoptosis and caspase-3 protein expression in DCIL-27+Aggroup, DCIL-27group and DCnaivegroup were higher than those in PBS group(control group). The membrane potential of mitochondria in DCIL-27+Aggroup, DCIL-27group and DCnaivegroup was higher than that in PBS group. The ratio of apoptosis and caspase-3 protein expression in DCIL-27+Ag, group, DCIL-27group and,DCnaivegroup were higher than those in Tnaive group, but the membrane potential of mitochondria in DCIL-27+Aggroup, DCIL-27group and DCnaivegroup was lower than that in Tnaive group. The ratio of apoptosis and caspase-3 protein expression in DCIL-27+Aggroup, DCIL-27group were higher than those in DCnaivegroup, but the membrane potential of mitochondria in DCIL-27+Aggroup, DCIL-27group was lower than that in DCnaivegroup. The ratio of apoptosis and caspase-3 protein expression in DCIL-27+Aggroup,were higher than those in DCIL-27group, but the membrane potential of mitochondria in DCIL-27+Aggroup was lower than that in DCIL-27group.ConclusionSpecific CTL, activated by DC modified with IL-27 gene and esophageal tumor lysate, efficiently play cytotoxic effect on tumor-bearing mice in vivo through reducing the mitochondrial membrane potential, initiating the intrinsic mitochondrial apoptotic pathways and increasing caspase-3 protein expression.

esophageal carcinoma; dendritic cells; interleukin 27; cell apoptosis

2016-04-01；

2016-10-25

河北省医学科学研究重点课题(20110136)

王少青(1981-)，男，河北隆尧人，河北省隆尧县医院主治医师，医学学士，从事胸外科疾病诊治研究。

*通讯作者。E-mail:yuankundu@163.com

R735.1

A

1007-3205(2016)12-1402-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.12.010