青蒿琥酯对高危MDS细胞株SKM-1中DNMT1表达的影响

王 颖，牛志云，邢丽娜，乔淑凯，潘 崚

(河北医科大学第二医院血液科，河北 石家庄 050000)



·论 著·

青蒿琥酯对高危MDS细胞株SKM-1中DNMT1表达的影响

王 颖，牛志云，邢丽娜，乔淑凯，潘 崚*

(河北医科大学第二医院血液科，河北 石家庄 050000)

目的以骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)细胞系SKM-1细胞为研究对象，在体外观察青蒿琥酯(artesunate，ART)对SKM-1细胞脱氧核糖核酸甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT1)基因表达的影响，以期为临床应用ART治疗中高危MDS患者提供体外实验的理论依据。方法ART干预体外细胞培养MDS细胞SKM-1细胞系，采用逆转录聚合酶链反应(revers transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法观察DNMT1的mRNA改变，采用蛋白印迹法观察DNMT1蛋白表达改变。采用实时定量RT-PCR法观察DNMT1靶基因p15INK4b表达的改变，采用甲基化PCR法观察p15INK4b启动子甲基化的改变。结果1、5、10 μmol/L的ART处理SKM-1细胞后DNMT1基因表达低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。1、5、10 μmol/L各剂量组间差异无统计学意义(P>0.05)。DNMT1蛋白表达1、10 μmol/L低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)； 1、10 μmol/L组低于5 μmol/L组，差异有统计学意义(P<0.05)；ART处理SKM-1细胞后DNMT1基因3、6、12 h处理组低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；3 h、6 h与12 h差异有统计学意义(P<0.05)。DNMT1蛋白3、6、12 h处理组低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。ART处理后p15INK4b的mRNA水平5、10 μmol/L组、地西他宾组高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。 p15INK4b的mRNA水平在10 μmol/L组是这5个处理组中最高的，并且1 μmol/L、5 μmol/L、地西他宾组与10 μmol/L组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；ART处理SKM-1细胞后DNMT1蛋白靶基因p15INK4b启动子甲基化程度下降，各组差异无统计学意义；ART组非甲基化启动子较其他2组上升，差异有统计学意义(P<0.05)。结论ART通过抑制DNMT1的转录和蛋白表达来恢复SKM-1细胞中的p15INK4b的表达，进而发挥其抑癌作用。

骨髓增生异常综合征；青蒿素；甲基转移酶类

近年来，在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)和骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)患者中频繁发现脱氧核糖核酸甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT1)基因突变,提示其可能在造血系统肿瘤中发挥不可替代的作用。抗疟药青蒿琥酯(atesunate，ART)属于青蒿素的衍生物，近年来发现，ART对肿瘤细胞发挥多重抗肿瘤效应。笔者以前曾报道ART在体外能对高危MDS细胞系SKM-1细胞发挥明显的增殖抑制作用[1]，但ART能否对MDS细胞的表观遗传学异常发挥改善作用，国内外尚未见相关报道。本研究在体外观察ART对SKM-1细胞DNMT1基因表达的影响，旨在为临床应用ART治疗中高危MDS患者提供体外实验的理论依据。

1 材料与方法

1.1试剂及药物 RPMI 1640培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒购自于日本同仁化学试剂研究所；ART购自桂林南药股份有限公司；PI试剂盒购于美国Biolegend公司。

1.2细胞培养 人类高危MDS细胞株SKM-1细胞购于日本JC-RB细胞库。将SKM-1细胞常规接种于RPMI 1640培养液(含10%胎牛血清)中，并添加入双抗(青霉素100 U/mL和链霉素10 mg/L)，然后将培养瓶置于5%CO2、饱和湿度37 ℃培养箱内进行细胞培养，收集处于对数生长期的SKM-1细胞进行后继实验。

1.3实时定量RT-PCR检测 收集经ART处理72 h的SKM-1细胞，用冷PBS充分洗涤2次，然后采用Trizol一步法提取细胞总RNA，并在18 g/L琼脂糖上电泳，可以看到存在3条清晰条带(28 s，18 s，5 s)，证明所提RNA模板完整；用紫外分光光度计测定吸光度A 260/A 280比值均>1.8，并根据A 280为1≌40 mg/L RNA进行含量测定。25 μL逆转录体系包含总RNA 2 μg，随机引物25 ng，5×RT缓冲液5 μL，dNTPs(2 mmol/L)1 μL，M-MLV逆转录酶(100 U/μL)1 μL，Rnasin(10 U/μL)2 μL，Mg2+(25 mmol/L)1 μL，双蒸水补足体系，37 ℃水浴60 min，94 ℃灭活逆转录酶，获取的cDNA于-20 ℃冰箱保存备用。引物设计参考GenBank中原始cDNA序列，经上海生物工程公司鉴定并合成。

PCR反应体系为25 μL，包括cDNA 2 μL，SYBR Green 1.25 μL，无氧核酸水10.75 μL，上、下游引物20 pmol/L各2 μL，余用双蒸水补至25 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min，然后95℃变性30 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40次循环结束。每一样本检测管和内对照β-actin的检测均做3个平行管，以保证结果的准确性。Ct值为扩增产物量达到临界域值时所对应的循环数，反应完毕后，将扩增的每份PCR产物进行熔解曲线分析，判断是否为特异性产物。测出每份标本目的基因和管家基因的Ct值，以目的基因的Ct值减去管家基因的Ct值得到ΔCt值，2-ΔCt即为目的基因相对于管家基因的相对表达量。引物序列由赛百盛公司设计并合成 DNMT1 5′-TACCTGGACGACCCTGACCTC-3′，5′-CGTTGGCATCAAAGATGGACA-3′ 扩增片段103 bp， β-actin 5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，5′-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′ 扩增片段434 bp。

1.4免疫印迹分析 处理前后细胞的DNMT1蛋白印记分析流程同本课题组前期文章流程[1]，Anti-DNMT1(Epitomics，美国)，兔抗GAPDH单克隆抗体(Santa Cruz，美国)。

1.5甲基化特异性PCR(MSP-PCR) DNA提取按照基因组DNA抽提试剂盒(离心柱式)说明书操作：收集最多不超过500万的细胞，离心沉淀后重悬于200 μL PBS中；加入20 μL蛋白酶K，Vortex混匀；加入200 μL样品裂解液B，Vortex混匀。70 ℃孵育10 min；加入200 μL无水乙醇，Vortex混匀；把步骤e中的混合物加入到DNA纯化柱内。≥6 000 g(约≥8 000 r/min)离心1 min。倒弃废液收集管内液体；加入500 μL洗涤液I，≥6 000 g(约≥8 000 r/min)离心1 min。倒弃废液收集管内液体；加入600 μL洗涤液Ⅱ，≥18 000 g(约≥12 000 r/min)离心1 min。倒弃废液收集管内液体；再≥18 000 g(约≥12 000 r/min)离心1 min，以去除残留的乙醇；将DNA纯化柱置于一洁净的1.5 mL离心管上，加入50～200 μL洗脱液。室温放置1～3 min。≥12 000 r/min 离心1 min。所得液体即为纯化得到的总DNA。 DNA 修饰：参照CpGenomeTM modification Kit说明书操作，取1 μg基因组DNA 加入100 μL 的DDW和7 μL 3 mol/L 的NaOH 混匀，放入50 ℃水浴中加热10 min。取出后每管中加入新鲜配制的DNA 修饰试剂Ⅰ550 μL，避光，50 ℃水浴16 h。取出后再向每管中加入充分重悬的DNA 修饰试剂Ⅲ 5 μL 和DNA 修饰试剂Ⅱ750 μL，轻轻混匀，室温放置10 min。5 000 g 离心 10 s，弃去上清，再用70%乙醇洗涤3次，并弃去上清。每管中再加入新鲜配制的20 mmol/L 的NaOH/90%乙醇溶液50 μL(即每mL 该溶液中含900 μL 无水乙醇，93.4 μL DDW 和6.6 μL 3 mol/L NaOH)，轻弹重悬团块，并室温放置5 min。5 000 g 离心10 s，弃去上清，再用90%乙醇洗涤3次，弃上清，室温干燥。每管加25 μL 的TE 溶解DNA，55 ℃水浴加热15 min 后取出，紫外分光光度计检测浓度和纯度，取A260/A280>1.8者进行下一步实验。-80 ℃保存备用。

PCR反应体系为25.0μL：修饰的DNA模板100 ng，MgCL21.5 mmol/L， 10×Taq 酶缓冲液2.5 μL，TaqDNA 合成酶1.0 U，dNTP 0.2 mmol/L， p15INK4b-M和p15INK4b-U 上、下游引物各0.25 μmol/L，余用无核酸酶的水补足至25 μL。反应条件为94 ℃ 10 min；94 ℃ 40 s，63 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，30 个循环；72 ℃ 12 min。同时设空白对照。反应产物4 ℃保存。取5 μL 反应产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，Goldview 染色，紫外灯下照相。结果分析：采用Gel-PRO analyzer 凝胶定量分析软件分析条带光密度。

引物序列由赛百盛公司合成[2]p15INK4b-M：5′-GCGTTCGTATTTTGCGGTT-3′，5′-CGTAC-AATAACCGAACGACCGA-3′ 扩增片段148 bp，p15INK4b-U：5′-TGTGATGTGTTTGTATTTT-GTGGTT-3′，5′-CCATACAATAACCAAACAA-CCAA-3′扩增片段154 bp。

1.6统计学方法 应用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学处理。计量资料比较分别采用单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同浓度的ART处理SKM-1细胞后DNMT1基因和DNMT1蛋白的表达 1、5、10 μmol/L的ART处理SKM-1细胞后DNMT1基因低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。1、5、10 μmol/L各剂量之间差异无统计学意义(P>0.05)。1、10 μmol/L DNMT1蛋白表达低于对照组，10 μmol/L组DNMT1蛋白表达低于5 μmol/L组，且差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2ART不同时间处理SKM-1细胞后DNMT1基因和蛋白的表达 3 h、6 h与12 h处理SKM-1细胞后DNMT1基因表达低于对照组(P<0.05)，12 h处理后DNMT1基因表达低于3 h组和6 h组(P<0.05)。3 h、6 h和12 h组DNMT1蛋白的表达低于对照组(P<0.05)；DNMT1蛋白3 h、6 h、12 h处理组间表达依次减低，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 各剂量组ART处理SKM-1细胞后DNMT1基因与蛋白比较Table 1 Comparison of DNMT1 gene and protein in each dose group of ART treated SKM-1 cells

表2 各时间点ART处理SKM-1细胞后DNMT1基因与蛋白比较Table 2 Comparison of DNMT1 gene and protein in ART treated SKM-1 cells at different time points

2.3各组ART处理后p15INK4b的mRNA水平比较 以80 μmol/L的去甲基化药物地西他滨作为阳性对照。ART处理后p15INK4b的mRNA水平在5、10 μmol/L组、地西他宾组高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。10 μmol/L组在各处理组间上升最高，与5 μmol/L组和地西他宾组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组ART处理后p15INK4b的mRNA水平比较Table 3 Comparison of mRNA levels of p15INK4b after ART treatment in each group

2.4各组ART处理SKM-1细胞后DNMT1蛋白靶基因p15INK4b启动子甲基化和非甲基化程度比较 ART处理SKM-1细胞后DNMT1蛋白靶基因p15INK4b启动子甲基化程度在ART处理组和地西他滨处理组有低于对照组的趋势，但差异无统计学意义；非甲基化启动子在ART处理组和地西他滨处理组高于对照组，且差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组ART处理后p15INK4b的启动子甲基化、非甲基化水平比较Table 4 After being treated with ART,methylation and unmethylation promoter of p15INK4b among each groups

3 讨 论

随着对表观遗传学在肿瘤发生发展中地位认识的不断深入，以表观遗传学为靶位的治疗日益受到重视。对老年患者为主的高危MDS来讲，表观遗传学修正治疗更是不能进行骨髓移植者的首选方案。DNA甲基化与肿瘤发生发展最为密切，在MDS尤为突出，多项研究显示MDS存在多个调节和执行DNA甲基化的基因突变或功能异常[3-5]。DNA甲基化转移酶抑制剂也在MDS中显示出较好的治疗前景。但是随着临床应用的增多，已发现存在地西他滨治疗原发或继发耐药的病例，最近的报道显示应用地西他滨治疗失败的患者预后通常是很差的[6-8]。之后的治疗通常包括强化疗、 雷那度安、临床试验治疗和(或)同种异体干细胞移植[9-11]。在某些情况下，改变去甲基化药物也许是另一种更好的选择,尤其是那些疾病稳定的患者，其不能耐受更强的化疗。MDS患者应用阿扎胞苷治疗过程中疾病进展或治疗失败后改换地西他滨治疗只有很少患者取得完全缓解[12]。

高危MDS及MDS/AML对ART诱导凋亡作用有较敏感的反应，对MDS的表观遗传是否也有修正作用未见报道，笔者选择在MDS表观遗传学主要的调节靶位DNMT1为观察指标[13]，观察ART处理SKM-1细胞后对细胞内DNMT1表达的影响。如果能下调DNMT1，则为ART治疗高危MDS进一步提供体外实验依据。

本研究进行RT-PCR和免疫印迹检测的结果均提示ART处理后DNMT1的转录水平和蛋白水平较未处理组下降。但未呈时间剂量依赖性模式，可能与ART剂量跨度较小，最高试验组剂量较低有关。进一步用实时定量PCR检测DNMT1靶基因p15INK4b的mRNA表达发现，未经ART处理时SKM-1细胞p15INK4b mRNA表达很低。在ART处理后12 h，p15INK4b的mRNA呈上升趋势。应用DAC处理SKM-1细胞作为阳性对照，发现在ART处理后p15INK4b也恢复表达。p15INK4b的mRNA水平在10 μmol/L组是这5个处理组中上升最高的，1 μmol/L、5 μmol/L、地西他宾组与10 μmol/L组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，但1 μmol/L、5 μmol/L 2组差异无统计学意义，出现这一现象可能因为青蒿琥酯剂量跨度小，而在低剂量时趋势不显著。这一点也可以证明在SKM-1细胞中p15INK4b被DNA超甲基化沉默，去甲基化处理可以在某种程度上恢复其表达。未处理的SKM-1细胞中p15INK4b表达极低，在ART处理后上升，结合前面DNMT1下降的结果提示ART可抑制SKM-1的DNMT1并恢复由其介导沉默的下游基因表达。接下来的p15INK4b启动子甲基化特异性PCR结果显示，ART处理后可以减低p15INK4b启动子甲基化程度，差异无统计学意义，但是启动子非甲基化程度明显上升，差异有统计学意义。说明ART恢复p15INK4b的表达机制中DNA去甲基化参与其中，至于结果显示差异无统计学意义，有以下几种可能：启动子甲基化比例基数较大，启动子非甲基化比例小，基数低，所以非甲基化比例变化较易体现出来；p15INK4b在SKM-1细胞中沉默的机制除DNA超甲基化外还有其他协同机制，如组蛋白修饰，ART作用于DNMT1的同时也影响了其他机制，促进了p15INK4b的恢复。抑癌基因p15INK4b在MDS中沉默率高达89%，常常作为观察DNMT抑制剂发挥去甲基化作用的标志[14]。其在G1/S点发挥作用，介导G0/G1期的周期阻滞，ART处理SKM-1细胞后p15INK4b恢复，也与前期的报道周期分析研究结果相吻合[1]。

本研究结果显示，ART通过抑制DNMT1的转录和蛋白表达来恢复SKM-1细胞中的p15INK4b的表达，进而发挥其抑癌作用。

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(本文编辑：刘斯静)

Effects of Artesunate on DNMT1 expression in high-risk MDS cell strain of SKM-1

WANG Ying， NIU Zhi-yun， XING Li-na， QIAO Shu-kai， PAN Ling*

(Department of Hematology, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China)

ObjectiveTo observe the effects of artesunate(ART) on gene expression levels of DNMT1 by using SKM-1 cells as the research object, and provide laboratory evidence in vitro for the usage of ART in MDS treatment.MethodsAfter being treated with ART(1, 5 and 10 μmol/L), DNMT1 mRNA changes in SKM-1 cells were observed with RT-PCR, and the protein expression changes were observed with West Blot. Then, the expression changes of p15INK4b, the DNMT1 targeting gene were observed by using real-time quantitative RT-PCR, and the changes of p15INK4b promoter methylation state were observed by using methylation PCR.ResultsAfter being treated with ART (1, 5 and 10 μmol/L), the difference was statistically significant for DNMT1 gene expression in SKM-1 cells compared with control group (P<0.05), but there was no significant difference in the three dose groups (1， 5 and 10 μmol/L) (P>0.05). As to DNMT1 protein expression, compared with 5μmol/L group, there was significantly lower in the other two groups (1 and 10μmol/L) (P<0.05), and also significantly lower than that in control group (P<0.05). However there was no significant difference among the other groups (P>0.05). After SKM-1 cells being treated with ART for 3 h, 6 h and 12 h, compared with control group, the difference of DNMT1 gene and protein expressions in the three groups (3 h, 6 h and 12 h) was significant (P<0.05). Besides, the difference of gene expression between the two groups (3 h, 6 h) and the 12 h group was also significant (P<0.05). But there was no significant different of protein expression in other treated groups (P>0.05). After SKM-1 cells being treated with ART, p15INK4B mRNA level of SKM-1 cells in the three groups (5 and 10 μmol/L groups, and decitabine group) was statistically higher than that in control group (P<0.05 ), with the level in 10 μmol/L group the highest in the five groups, and the significant difference was only found between 10 μmol/L group and the four groups (control group, 1μmol group, 5 μmol group and decitabine group) (P<0.05). After being treated with ART, p15INK4b promoter methylation level was decreased in SKM-1 cells, but the difference was not significant (P>0.05). On the contrary, the level of promoter unmethylation state in ART group was increased compared with two other groups (control group and the decitabine group) (P<0.05).ConclusionART can restore the expression of p15INK4b by inhibiting DNMT1 transcription and protein expression in SKM-1 cells, and thus to suppress tumor.

myelodysplastic syndromes； artemisinin； methyltransferases

2016-05-10；

2016-08-01

王颖(1972-)，女，河北衡水人，河北医科大学第二医院副主任医师，医学博士，从事血液病诊治研究。

R551.3

A

1007-3205(2016)12-1374-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.12.003

*通讯作者