microRNA—451在肝癌患者血浆中的表达及意义

李斌　杨筱君

[摘要] 目的 探讨microRNA-451（miR-451）在肝癌患者血浆中的表达水平及其临床意义。 方法 选择2015年3～10月在枣庄矿业集团中心医院住院治疗的42例肝癌患者和42例健康体检者作为研究对象，利用定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测血浆中miR-451的表达水平，分析肝癌患者血浆中miR-451表达水平与临床病理参数的关系。 结果 miR-451在肝癌患者血浆中表达水平（0.43±0.16）明显低于对照组（0.59±0.21），差异有高度统计学意义（P < 0.01）；肝癌患者血浆中miR-451水平在不同性别、年龄、分化程度及甲胎蛋白水平间差异无统计学意义（P > 0.05），而与肿瘤大小、淋巴转移、静脉侵犯、肿瘤数量及TNM分期明显相关（P < 0.05）。 结论 肝癌患者血浆中miR-451表达水平降低，可能参与了肝癌的发病过程。

[关键词] 肝癌；microRNA-451；临床意义；血浆

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）10（b）-0087-04

[Abstract] Objective To explore the plasma levels of microRNA-451 （miR-451） and their clinical significances in patients with hepatocellular carcinoma. Methods 42 patients with hepatocellular carcinoma and 42 healthy controls in Central Hospital of Zaozhuang Coal Mining Group from March to October 2015 were enrolled in the study. The plasma levels of miR-451 were detected by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）. The relationships between clinical pathological characteristics and the plasma levels of miR-451 of hepatocellular carcinoma were analyzed. Results The plasma level of miR-451 in the patients with hepatocellular carcinoma （0.43±0.16） was lower than that in healthy controls （0.59±0.21）， with statistically significant difference （P < 0.01）. There were no statistically significant differences in plasma levels of miR-451 among patients with different gender， ages， tumor differentiations， AFP levels （P > 0.05）， but which had statistically significant differences among patients with different tumor sizes， lymph node metastasis， venous invasion， tumor numbers and TNM stages （P < 0.05）. Conclusion The plasma levels of miR-451 decrease in the patients with hepatocellular carcinoma， which may participate in the pathology of hepatocellular carcinoma.

[Key words] Hepatocellular carcinoma； microRNA-451； Clinical significance； Plasma

原发性肝癌简称肝癌，是指起源于肝细胞或肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤，是我国常见的恶性肿瘤之一，死亡率在恶性肿瘤中居第2位。肝癌的病因和发病机制尚未完全清楚，可能与病毒性肝炎、食物与饮水、毒物与饮水及遗传因素等有关[1]。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一类长度为18～25个核苷酸的单链非编码RNA，不编码蛋白，主要通在转录后水平发挥基因调节作用。研究证实，miRNAs与实体肿瘤及血液系统恶性肿瘤的发生发展密切相关[2-3]。国内外研究证实多种miRNAs在肝癌的发生发展过程发挥了一定作用，与肝癌的早期诊断、治疗及预后密切相关[4-5]。miR-451是2005年发现的一种miRNA。多项研究发现，miR-451在多种实体瘤及血液系统肿瘤中表达异常[6-13]。国内学者研究发现，miR-451在肝癌细胞系、肝癌组织中表达水平下调[14-16]。本研究采用定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）检测miR-451在肝癌患者血浆中的表达水平，并分析其与肝癌临床病理参数及甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）之间的关系，初步探讨miR-451在肝癌发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年3～10月在枣庄矿业集团中心医院肿瘤外科及肝胆外科住院治疗的肝癌患者42例，其中，男34例，女8例；年龄40～73岁，平均（52.46±10.37）岁。所有患者均经过术后病理证实为肝细胞肝癌，排除合并自身免疫性疾病、转移性肝癌、炎症性疾病及严重的心肾疾病者。选择42名正常的健康体检者为对照组，其中，男31名，女11名；年龄39～70岁，平均年龄（50.73±9.81）岁。本研究方案经医院伦理委员会批准，所有研究对象均知情同意并签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器

miRNA-提取分离试剂盒、miRNA cDNA第一链合成试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司产品，实时定量PCR试剂盒为德国Qiagen公司产品，高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司，紫外分光光度计购自美国基因有限公司，实时定量PCR扩增仪购自美国Bio-Rad公司，Cobas E601全自动电化学发光免疫分析仪购自瑞士Roche诊断公司。

1.3 方法

1.3.1 定量RT-PCR检测血浆中miR-451表达水平 所有研究对象均空腹无菌采集5 mL静脉血，放入EDTA抗凝管中，均在手术、放疗或化疗等抗肿瘤治疗前进行血样采集。采集的血样在25℃下2500 r/min离心10 min后吸取上层血浆至EP管中，再4℃ 12 000 r/min离心10 min后收集上层血浆至新的EP管中，-80℃保存用于实验。

血浆中总RNA提取采用miRNA-提取分离试剂盒，利用紫外分光光度仪检测RNA溶液OD260及OD280值并计算OD260/OD280值，比值在1.8～2.1之间的RNA溶液符合质量要求，用于后续实验。

使用miRNA cDNA第一链合成试剂盒进行cDNA第一链合成，实验操作严格按照试剂盒说明书进行。根据文献[17-18]分别合成miR-451、内参照U6的逆转录引物及PCR引物，miR-451逆转录引物序列：TCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGA AA CTCAGT，PCR上游引物序列：AAACCGTTACCATTACTGAG，下游引物序列：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG；U6逆转录引物序列：AACGXTTCACGAATTTGCGT，PCR上游引物序列：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物序列：AACGXTTCACGAATTTG CGT。采用SYBRR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂进行PCR反应。20 μL反应体系包括上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ 10 μL、3.0 μL模板及5.0 μL双蒸水。反应条件为：95℃预变性3 min，然后95℃ 5 s、62℃ 40 s，进行35个循环，每个样本的每个基因均设立3个复孔，PCR反应结束后自动获得循环阈值（CT值）。采用2-ΔΔCT计算miR-451在血浆中的表达水平。

1.3.2 电化学发光法测定血清中AFP水平 肝癌患者空腹抽取3 mL静脉血，3000 r/min离心5 min后吸取上层血清，采用全自动电化学发光免疫分析仪进行血清AFP水平测定，严格按照操作说明书进行。

1.4 统计学方法

所有数据均采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血浆中miR-451表达水平比较

采用定量RT-PCR检测两组血浆miR-451表达水平，结果显示，miR-451在肝癌患者血浆中表达水平为（0.43±0.16），明显低于对照组（0.59±0.21），二者差异有高度统计学意义（t=3.928，P < 0.01）。

2.2 血浆中miR-451表达水平与肝癌临床病理参数的关系

结果显示，肝癌患者血浆中miR-451表达水平在不同性别、年龄、分化程度及AFP水平之间差异无统计学意义（P > 0.05）；与肿瘤≤5 cm、无淋巴转移、静脉侵犯阴性及单发肿瘤患者相比，肿瘤>5 cm、有淋巴转移、静脉侵犯阳性及多发肿瘤的肝癌患者血浆中miR-451表达水平分别明显降低，差异均有统计学意义（P < 0.05），TNM分期为Ⅲ/Ⅳ期肝癌患者血浆中miR-451水平明显低于Ⅰ/Ⅱ期患者，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

3 讨论

肝癌是常见的恶性肿瘤之一，对化疗和放疗不敏感，早期治疗性切除是目前治疗肝癌最有效的方法，早期诊断是提高手术效果的关键，但肝癌早期诊断较为困难，寻找早期诊断指标是肝癌研究领域中迫切需要解决的问题。miRNA主要通过与靶基因mRNA的3端非编码区域结合，降解靶基因或抑制靶基因的表达，从而发挥基因调节作用，广泛参与了细胞增殖、凋亡、分化等生理病理过程。国内外大量研究证实，miRNAs在许多肿瘤中表达上调或下调，参与了肿瘤的病理过程[2-3]。研究发现，miR-10、miR-21、miR-221及miR-224等在肝癌中表达上调，而miR-101、miR-122、miR-199、miR-214等在肝癌中表达下调，同时多种miRNA与肝癌的转移、预后及治疗反应性密切相关[4-5]。

miR-451是在人脑垂体RNA研究中新发现的miRNA，基因定位于人19q11.2。研究证实，miR-451在肿瘤组织中表达异常[6-13]。与癌旁组织相比，膀胱癌[8]、骨肉瘤[9]、鼻咽癌[10]、肺癌[11]、结肠癌[12]及甲状腺癌[13]等多种肿瘤组织中miR-451的表达水平降低。有学者研究发现，与癌旁组织相比，肝癌组织中miR-451表达水平下调且与临床分期、转移及预后有关[14]。体外细胞实验研究发现，miR-451在肝癌细胞系HepG2和SK-Hep-1中表达水平下调，可以抑制肿瘤细胞生长、迁移及侵袭，促进凋亡[15]。Li等[16]也证实，miR-451在肝癌组织与细胞中的表达明显下调，下调miR-451可以促进肝癌细胞的增殖，而上调则抑制肝癌细胞的增殖。研究证实，miRNA由于长度较短且具有较强的抵抗RNA酶降解作用，可以在血液中稳定存在[17-22]，是一种理想的肿瘤标志物。目前研究发现，外周血中miR-21、miR-26a、miR-27a、miR-122、miR-192等多种miRNAs有望成为肝癌早期诊断指标[5]。多项研究发现，乳腺癌[23]、肾癌[24]、肺癌[25]患者血浆或血清中miR-451表达异常，与肿瘤的诊断及预后有关。为了探讨miR-451在肝癌发生发展中的作用，本实验采用定量RT-PCR法检测了肝癌患者血浆中miR-451的表达水平，结果发现，与对照组相比，肝癌患者血浆中miR-451的表达水平明显降低（P < 0.01），这与相关研究结果一致[14-16]。提示miR-451是一种抑癌miRNA，肝癌患者体内miR-451水平降低，促进了肿瘤的发生。本研究还统计分析了血浆中miR-451表达水平与肝癌临床病理参数之间的关系，结果显示，肝癌患者血浆中miR-451水平在不同性别、年龄、分化程度及AFP水平之间差异无统计学意义（P > 0.05），而与肿瘤大小、肿瘤数量有关，且Ⅲ/Ⅳ期肝癌患者血浆中miR-451水平明显低于Ⅰ/Ⅱ期患者（P < 0.05）。提示miR-451水平的降低不仅参与了肝癌的发生过程，而且与肝癌的发展过程有关，但其具体作用的机制尚不完全清楚。进一步分析表明，发生淋巴转移、静脉侵犯的肝癌患者血浆中miR-451水平明显降低，这与以往的研究结果基本一致[16-17]。提示低水平miR-451容易导致肝癌发生转移，miR-451可能发挥抑制肝癌转移的作用。随着对miR-451研究的不断深入，可能为进一步解决肝癌临床转移复发提供新的思路。

综上所述，肝癌患者血浆中miR-451表达水平降低，且miR-451的表达水平与肝癌肿瘤大小、淋巴转移、静脉侵犯、肿瘤数量及临床分期有关，提示miR-451可能参与了肝癌的病理过程。但血浆中miR-451的来源及其在肝癌发生发展中的具体作用机制尚不清楚。随着对miR-451在肝癌中作用研究的不断深入，可能为肝癌的早期诊断、判断预后及治疗提供新的靶点。

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（收稿日期：2016-07-12 本文编辑：程 铭）