水稻二化螟和三化螟基因组ddRADseq文库的构建

杨 琼，孙 娜，郑 敏，罗除成，罗光华*，方继朝*

(1.江苏省农业科学院植物保护研究所，南京210014；2.南京农业大学植物保护学院，南京210095)



水稻二化螟和三化螟基因组ddRADseq文库的构建

杨 琼1*，孙 娜1, 2*，郑 敏1，罗除成1，罗光华1**，方继朝1**

(1.江苏省农业科学院植物保护研究所，南京210014；2.南京农业大学植物保护学院，南京210095)

本文介绍了构建水稻二化螟和三化螟“双酶切限制性酶切位点关联DNA测序”(Double digest restriction-site associated DNA sequencing，ddRADseq)文库的方法。利用安捷伦2100生物分析仪对4种单酶切及2种双酶切的酶切产物片段大小及分布范围进行分析，筛选出MluC I和NlaIII两种限制性内切酶组合对螟虫基因组DNA进行酶切。酶切后的DNA片段两端连接上特定的P1、P2接头后，用Pippin Prep回收大小为285-435 bp的DNA片段。通过PCR扩增进行文库的富集并引入index序列。构建好的ddRADseq文库用琼脂糖凝胶电泳和生物分析仪进行质量检测。本方法所构建的文库DNA片段长度、分布和摩尔浓度能够达到Illumina平台测序的技术要求。本研究证实了利用MluC I和NlaIII组合酶切构建水稻螟虫基因组ddRADseq文库的可行性，为在水稻螟虫中利用ddRADseq技术开展生物地理学、种群遗传学和系统发育重建等方面的研究奠定基础。

基因组DNA文库；ddRADseq；生物分析仪；水稻螟虫

二化螟Chilosuppressalis(Walker) 和三化螟Scirpophagaincertulas(Walker) 是我国水稻上的重要钻蛀性害虫，危害范围广，可造成重大的经济损失(盛承发等，2003)。目前，对二化螟和三化螟的防治主要依赖化学农药，但化学农药的长期及大量使用使它们产生了明显的抗药性，并且造成农药残留和环境污染(吴孔明等，2009)。因此，迫切需要开发出更高效环保的治螟技术与方法。

1.事前管理不到位，造成税款流失。简政放权后，有很多税务事项取消行政审批，不需进行事前调查。同时，对税务机关进户执法进行了规范，税务人员进户检查的次数相对减少，这就有可能导致难以第一时间发现纳税人的违法行为。如纳税人领用10万元以下增值税专用发票，不需要税务人员做事前实地查验，有的纳税人趁机虚开发票后走逃。又如出口退税无纸化后，则很难对电子数据进行保存和核查取证，企业出现违规退税、骗税，难以追责，造成税款流失。

害虫一般都具有很强的环境适应性。种群具有高适应性是基于其内在丰富的遗传多样性。研究害虫种群的遗传多样性，一方面是探索害虫种群遗传分化的机制，另一方面则是寻找治理害虫新策略的突破口(韩海斌等，2013；周宇等，2013)。种群遗传多样性研究是基于各种分子标记开展的，如微卫星、线粒体DNA基因(CO I，CO II)、转座子等(Mengetal.，2008)。随着科技的进步与技术的发展，基于二代测序技术的简化基因组测序技术为种群遗传学研究提供了更丰富而准确的分析数据(翟正晓，2014；魏书军等，2016)。在各种简化基因组测序技术中，发展最快且应用最广泛的是限制性酶切位点关联DNA测序技术(Restriction-site associated DNA sequencing，RADseq)。该技术体系具有通量较高、成本偏低、试验周期较短并且无需参考基因组等优点(Petersonetal.，2012)。经过不断发展，RADseq技术已经有了多种版本，如mbRAD、ddRAD、2bRAD、ezRAD、nextRAD等，能满足多种不同的试验设计与要求(Andrewsetal.，2016)。其中，双酶切限制性酶切位点关联DNA测序(Double digest restriction-site associated DNA sequencing，ddRADseq)技术具有成本低、SNPs位点数量多且准确等优势，故很多研究利用该技术方案开展相关的研究(Willingetal.，2011; Petersonetal., 2012)。

ddRADseq的技术特点是利用2种限制性内切酶组合对基因组DNA进行双酶切构建基因组DNA测序文库。该技术能够大幅度降低基因组复杂度，快速获得每个样本的基因型，在整个基因组范围内鉴定出高密度的SNP位点，可以用于构建未知基因组序列生物的高密度遗传连锁图谱，QTL定位、寻找DNA多态性和群体进化研究(王冠杰等，2012；王莹，2014)。该技术策略可以高效、准确、低成本的确定生物的基因型，是一种非常实用的研究方法，在复杂基因组研究领域具有广泛地应用前景(王洋坤等，2014)。

事业渐渐做得大了起来，忙忙碌碌的、马不停，张雪松总是觉得，在潜意识中还有那么一件事情没有做，但是是什么呢？有一年，初秋将至，老张忽然想吃妈妈亲手做的美食。而那些幼时的玩伴，是否和他一样，总是能想起儿时记忆中的香气。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

从安徽和县水稻田采集的二化螟和从江西瑞昌水稻田采集三化螟，经饥饿处理后单头虫体浸泡在95%乙醇中，置于-80℃冰箱保存备用。

课程对指标点达成度=权重系数×样本中与该毕业要求指标点对应课程的相关试题平均分/样本中与该毕业要求指标点对应课程的相关试题满分。

1.2.6 PCR富集和index序列引入

今年以来，我国经济运行总体平稳，稳中有进，国民经济长期向好的态势没有改变。但影响全球经济稳定的不确定因素仍然较多，出口仍面临不少挑战和压力。要致力于提高产品质量，不断推出创新款式，在抓出口机遇的同时，培育和抢占新兴市场。

构建ddRADseq文库的主要步骤：①基因组DNA的提取；②限制性内切酶的筛选；③基因组DNA双酶切反应；④酶切后的DNA片段两端连接含barcode的P1和P2接头；⑤Pippin Prep全自动核酸片段回收仪回收目的DNA片段；⑥PCR扩增对文库进行富集。

1.2.1 基因组DNA的提取

2.3 DNA文库的琼脂糖凝胶电泳和Bioanalyzer检测分析

1.2.2 限制性内切酶的筛选

大都市区进行综合交通体系规划建设，包括核心层级和辅助层级，区域通过打造三个交通核心点、十一条交通主道次级中心的布局结构，形成多样式、多层次的混合联运交通运输体系。其中十一条主道次级中心就有奉新交通次级枢纽，在即将并网形成的高速公路网格局中，有重要的东乡-昌傅-奉新高速。后期将新建奉新基地通用机场。

选择合适的限制性内切酶是构建文库的关键步骤。不仅要保证产生的RAD标记能够在基因组上均匀分布，同时所获得的RAD标记数量能够覆盖一定比例的基因组，这样才可以用于后续的SNP检测和个体及种群的遗传分化分析。RAD位点即一段相邻于某一个或者一组限制性内切酶酶切位点的DNA片段(Petersonetal.，2012)。本研究用安捷伦Bioanalyzer 2100芯片分析系统(Agilent公司，美国)分析不同限制性内切酶组合产生的DNA片段的数量、摩尔浓度以及在整个基因组的分布。本研究选用了MluC I(4 bp site, 0% G/C)、NlaIII(4 bp site, 50% G/C)、EcoR I(6 bp site, 33% G/C)、SphI(6 bp site, 66% G/C)(NEB公司，美国)4种内切酶，他们都能在NEB Buffer中保持完全的活性，并且可以组合进行双酶切。使用50 μL的酶切体系，反应体系配制如下：10×CutSmart Buffer 5 μL，限制性内切酶 1 μL(单酶切)/2 μL(双酶切)，gDNA 120 ng，最后ddH2O补齐至50 μL(表1)。按照表1配制酶切反应体系，充分混匀后，短暂离心，于37℃孵育3 h。酶切反应结束后，用1.5×AMPure XP beads浓缩、纯化，最终用40 μL ddH2O溶解DNA于-20℃冰箱保存备用。

表1 限制性内切酶酶切反应体系

Table 1 Reaction system of restriction enzyme

酶切类型TypesBuffer种类Typesofbuffer内切酶Enzyme反应体系(50μL)Reactionsystem单酶切CutSmartbufferMluCIDNA+H2O：35μLCutSmartbufferNlaIII Buffer：5μLEcoRIbufferEcoRI 酶：1μL21SphI H2O：9μL双酶切21EcoRI&SphIDNA+H2O：35μLCutSmartbufferMluCI&NlaIII Buffer：5μL 酶：2μL H2O：8μL

用Qubit测定酶切纯化产物的DNA浓度后用安捷伦2100生物分析仪进行检测。芯片的使用参照High Sensitivity DNA Chips试剂盒说明进行。酶切产物用生物分析仪检测后，经计算分析，最终确定选择MluC I和NlaIII进行基因组DNA的酶切。

1.2.3 基因组DNA的双酶切反应

随着信息技术的发展，企业在经济生产活动中产生了大量的数据，会计信息化管理能够节约会计人员工作时间，提高会计工作效率。面对日益激烈的市场竞争环境，建立会计信息化管理模式成为企业发展的必然选择。企业要不断完善会计管理制度，优化部门分工结构，提升会计工作水平。

直接选用NlaIII和MluC I双酶切组合进行后续试验。提取好的gDNA，用Qubit测定各样本gDNA的浓度，随后计算每个样本酶切反应所需的gDNA量。利用限制性内切酶NlaIII和MluC I对每个样本gDNA进行双酶切，反应体系及酶切方法同上。酶切后的DNA利用1.5×AMPure XP Beads进行纯化并于4℃保存备用。

1.2.4 酶切产物的接头连接

酶切纯化后的DNA经Qubit测定浓度后，用T4 DNA连接酶(NEB)连接P1、P2接头。连接反应体系如下：DNA(35 ng)+ ddH2O 35 μL，T4 DNA Ligase Buffer 4.5 μL，T4 DNA Ligase 0.55 μL，P1接头2 μL，P2接头2 μL，最后用ddH2O补齐至45 μL。将以上反应体系置于16℃ PCR仪中过夜孵育。过夜孵育结束后，65℃孵育10 min，再以每90 s退火2℃的速度循环22次，最后的连接产物用1.5×AMPure XP Beads纯化，再用Qubit检测连接反应后DNA的浓度。纯化后的连接产物于于4℃保存备用。连接反应后，每个样本都连接上可以用于区分个体的独一无二的Barcode组合，将一定数量个体的酶切DNA合并至一个文库。

11 刘译：...and that their understanding of the Way is similar.[4]38

利用限制性内切酶MluC I和NlaIII对二化螟和三化螟个体的基因组DNA进行双酶切后，用2.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，酶切后的基因组DNA呈现为一条弥散的条带，大部分片段集中于200-400 bp之间(图1)。

1.2.5 目标DNA片段的收集

利用Pippin Prep全自动核酸电泳和片段回收系统(sage science公司，美国)收集目标片段。回收系统的使用参照说明书进行。本文库需要收集大小在285-435 bp(含85 bp接头)的DNA片段，收集后的DNA产物再用Qubit测定浓度。

1.2 双酶切方法构建水稻螟虫基因组ddRADseq文库

经过片段大小选择、回收后的DNA作为模板，利用含Illumina测序平台对应的引物(10uM)Primer F(5′AATGATACGGCGACCACCGAGATCTA CACTCTTTCCCTACACGACG 3′)和Primer R(5′CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGG ACGTGTGC3′)进行PCR扩增，将两端连有P1和P2接头的目的片段进行富集，同时引入index序列(下划线部分所示)。如研究需要构建多个文库，可以设计多条含有不同6 bp 长度的index序列的反向引物进行PCR扩增，测序完成后根据每个文库特定的index序列来区分不同的文库。Index和Barcode的使用增加了每个测序孔中样本的数量，降低了试验成本。10 μL PCR扩增体系为：PCR phusion 2X master mix 5 μL，PCR Illumina primer F(10 uM)2 μL， PCR Illumina primer R(10 uM)2 μL，DNA 1 μL。反应条件为：98℃预变性30 s；98℃ 10 s，65℃ 30 s，98℃ 45 s，12个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。最终用于Illumina平台测序的gDNA文库使用Qubit和生物分析仪进行检测分析。

灵隐寺主要以天王殿、大雄宝殿、药师殿、直指堂（法堂）、华严殿为中轴线，两边附以五百罗汉堂、济公殿、联灯阁、华严阁、大悲楼、方丈楼等建筑所构成，共占地130亩，殿宇恢宏，建构有序。灵隐寺自创建以来，高僧云集，文人荟萃，儒释交融，谈禅论道，一吟一咏早已蔚为大观。此外，寺内还存有不少年代久远的佛像、法器、经幢、石塔、御碑、字画等历史文物，为灵隐寺珍贵的佛教文化遗产。

2 结果与分析

2.1 酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测

4.1.3 全面业务分析、跨条线数据整合分析、统一平台、升华管理及业务效率和质量，全面展现智慧水务效用

图1 二化螟基因组DNA双酶切后电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of gDNA double digestion products of Chilo suppressalisM,DNA Ladder；L,gDNA酶切产物。M, DNA Ladder; L, gDNA digestion products of C.suppressalis.

2.2 限制性内切酶选择的Bioanalyzer分析

躁狂是情感障碍疾病中较为常见的一种,该病的临床主要表现为思维奔逸、情感高涨和意志行为增强。利培酮是治疗精神性疾病的一种非典型性药物,其可作为一种受体阻断剂作用于多种脑神经传递质,遵循躁狂症的发病机理原则治疗躁狂症。利培酮具有依从性较好、服用方便、起效快等特点。

分别使用MluC I、NlaIII、EcoR I、SphI单酶切及MluC I-NlaIII、EcoR I-SphI的双酶切酶切组合对二化螟和三化螟的gDNA进行酶切，酶切产物安捷伦2100生物分析仪进行检测，结果分析如图2。MluC I(50-3000 bp)、NlaIII(500-3000 bp)、EcoR I(1000-7000 bp)、SphI(2000-7000 bp)4种酶的单酶切和EcoR I-SphI(2000-8000 bp)双酶切组合产生的DNA片段大小及分布均不符合Illumina测序平台(PE125)和后续实验目的要求。MluC I和NlaIII均为4碱基内切酶，切割底物的频率更快，MluC I-NlaIII组合酶切产生的DNA片段大小主要分布在100-300 bp，完全满足后续实验对RAD tag的要求。将MluC I和NlaIII单酶切、双酶切的Bioanalyzer数据结合二化螟和三化螟基因组大小进行计算，得到MluC I和NlaIII双酶切产生的DNA片段在各种大小范围内的数量(表2)。因Illumina测序平台(PE125)的读长是125 bp，所以选择的DNA片段大小原则上应≥ 250 bp，但计算后发现，如全部舍弃250 bp以下的片段，将会导致丢失大部分RAD位点。因此决定选择200-350 bp的范围，在这个范围内，二化螟共有397060个DNA片段，三化螟有344973个DNA片段(表2)。

表2MluC I和NlaIII双酶切产物的Bioanayzer分析

Table 2 Bioanalyzer analysis of bothMluC I andNlaIII digestion products

片段范围(bp)Sizeregion二化螟DNA片段数CsuppressalisfragmentNo三化螟DNA片段数SincertulasfragmentNo50-100668652504066100-150603697527641150-200368637326780200-250203037183091250-300123934103540300-3507008958342350-4005057833681

利用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit试剂盒(Qiagen公司，德国)单头提取试虫的gDNA，提取方法参照试剂盒说明书。取单头虫体置于吸水纸上，使其表面彻底晾干，经液氮速冻后迅速研磨虫体，然后按照试剂盒的使用说明进行操作。gDNA经1.5%的琼脂糖凝胶电泳和Qubit®3.0型荧光计(Invitrogen公司，美国)测定浓度和纯度后保存于-20℃冰箱。

利用Qubit检测构建的ddRAD文库的浓度，然后用2.5%的琼脂糖凝胶电泳和生物分析仪进行检测分析(图3)。从图3中可以看出，2.5%琼脂糖凝胶电泳图谱和生物分析仪电泳图谱较为一致，DNA片段均集中在330-480 bp，表明成功构建了二化螟和三化螟的目标基因组DNA文库，可以在Illumina测序仪上进行测序。

访山东倍丰盐湖农业科技有限公司董事长焦坤告诉记者，这次合作是资源与网络的完美结合，是品牌与渠道的双向联合，是贸易与实体的相互补充，是厂商合作的典范，更是山东倍丰转型升级的全新力作。

图2 各种酶切产物的Bioanalyzer分析Fig.2 Bioanalyzer analysis of various combinations of restriction enzymesA，DNA Ladder；B，二化螟gDNA酶切；C，三化螟gDNA酶切。A, DNA Ladder; B, digestion of C. suppressalis gDNA; C, digestion of S. incertulas gDNA.

图3 基因组DNA文库的琼脂糖凝胶电泳和Bioanalyzer分析Fig.3 Analysis of agarose gel electrophoresis and Bioanalyzer for gDNA libraryA，基因组ddRADseq文库琼脂糖凝胶电泳分析；B，基因组DNA文库Bioanalyzer分析。M为DNA Ladder，L1为二化螟基因组ddRADseq文库，L2为三化螟基因组ddRADseq文库。A, Electrophoresis analysis of ddRADseq library; B, Bioanalyzer analysis of ddRADseq library. M, DNA Ladder; L1, ddRADseq library of C. suppressalis; L2, ddRADseq library of S. incertulas.

3 结论与讨论

二化螟和三化螟作为水稻上的重要害虫，一直受到关注，其遗传多样性研究也是害虫综合治理的重要研究内容之一。本研究利用筛选出2种高频率限制性内切酶并对二化螟和三化螟基因组DNA进行酶切，成功构建ddRADseq文库，为深入开展其种群遗传学研究奠定了重要基础。

随着二代测序技术的发展，各类简化基因组测序技术迅速发展起来，这为种群遗传学带来了极大的便利。RADseq技术是基于全基因组酶切位点的简化基因组测序技术，最早应用于三刺鱼的生态特性遗传学研究(Daveyetal.，2010)。早期的RAD文库制备过程通常包含酶切、连接P1接头、物理打断、末端修复、连接P2接头、片段选择等几个步骤，物理打断和琼脂糖凝胶电泳进行片段选择的过程可能会造成DNA的损伤及损失。而ddRADseq技术(Petersonetal.，2012)中2种限制性内切酶的目的性更强，免去了随机打断的过程，结合Pippin Prep全自动核酸电泳和片段回收系统精确的片段选择技术，从而对DNA文库的筛选更严格。两种限制性内切酶的组合使用和严格的片段选择不仅降低了基因组的复杂度，而且简化了文库的制备过程(Busetal.，2012; Pukketal.，2015)。

生物分析仪是基于生物芯片技术的核酸分析系统，在基因差异表达研究中具有重要的应用价值。与传统的琼脂糖凝胶电泳相比，生物分析仪可以更简便、精确、直观地对DNA片段的大小、分布范围以及摩尔浓度进行定量分析，可以清晰地显示短至50 bp的DNA条带和低至0.02 ng的DNA片段，灵敏度更高。检测仅需1 μL的实验样本，克服了传统的琼脂糖凝胶电泳的局限性。在DNA、RNA、蛋白质和细胞样品的分析中都发挥了重要的作用(刘翠华等，2002)。该核酸分析系统在制备本研究所涉及的基因组ddRADseq文库过程中起到重要的作用。

目前，尚无关于构建二化螟和三化螟基因组文库的报道。本研究证实了用双酶切方法构建水稻螟虫基因组ddRADseq文库的可行性。由于RADseq数据的分析不需要参考基因组序列就可以产生大量的SNP标记，结合传统的形态学、生理学、生态学等方法，该技术可以广泛地应用于模式生物和非模式生物的种群遗传学、系统发生生物地理学、系统发育、物种界定、遗传图谱构建等诸多领域的研究，也将在昆虫学研究中发挥重要的作用(Houstonetal.，2012; 魏书军等，2016)。相比RADseq技术，ddRADseq技术大大简化了实验流程，但同时也存在着多次选酶、使用仪器复杂等缺点，Pukk等(2015)人开发出一种被子植物通用的双酶切简化基因组(Modified ddRAD，MiddRAD)二代测序文库构建方法，免去了多次选酶、定量、纯化产物等步骤，优化了复杂的建库仪器，降低了实验成本。随着技术的不断优化，ddRADseq技术将成为昆虫遗传学研究的重要手段，也将在其它研究领域中发挥更大的应用价值。

在进一步深化大学英语教学改革的热潮下，面对本科办学历史较短、办学经验不足、办学条件也较有限的办学实情，新升格本科院校的艺体类本科大学英语教学改革所面临的压力和挑战可想而知。但是，只要切实结合自身的办学实情，严格遵循“分类指导、因材施教”、“动态分层”、“课程教学渐进性、持续性和灵活性”等原则，将分类分层教学模式与课程阶段递进式教学模式、必修课程和选修课程有机结合，勇于实践和创新，新升格本科院校就一定能开辟出一条独特的艺体类本科大学英语教学之路，培养出新时期国家和社会所需要的艺体类复合型人才。

References)

Andrews KR, Good JM, Miller MR,etal. Harnessing the power of RADseq for ecological and evolutionary genomics[J].NatureReviewsGenetics, 2016, 17(2).

Bus A, Hecht J, Huettel B,etal. High-throughput polymorphism detection and genotyping inBrassicanapususing next-generation RAD sequencing[J].BMCGenomics, 2012, 13(13): 281.

Davey JW, Davey JL, Blaxter ML,etal. RADSeq: Next-generation population genetics[J].BriefingsinFunctionalGenomics, 2010, 9(5-6): 416-23.

Han HB, Zhou XR, Pang BP,etal. Microsatellite marker analysis of the genetic diversity ofOedaleusasiaticus(Orthoptera: Acrididae) populations in Inner Mongolia, Northern China[J].ActaEntomologicaSinica, 2013, 56(1): 79-87. [韩海斌, 周晓榕, 庞保平, 等. 内蒙古亚洲小车蝗种群遗传多样性的微卫星分析[J]. 昆虫学报, 2013, 56(1): 79-87]

Houston RD, Davey JW, Bishop SC,etal. Characterisation of QTL-linked and genome-wide restriction site-associated DNA (RAD) markers in farmedAtlanticsalmon[J].BMCGenomics, 2012, 13(1): 1-15.

Liu CH, Ma WL, Shi R,etal. Application of agilent 2100 bioanalyzer in the study of differential gene expression[J].AcademicJournaloftheFirstMedicalCollegeofPLA, 2002, 22(12): 1066-1069. [刘翠华, 马文丽, 石嵘, 等. Agilent 2100 Bioanalyzer在基因差异表达研究中的应用[J]. 第一军医大学学报, 2002, 22(12): 1066-1069]

Meng XF, Shi M, Chen XX. Population genetic structure ofChilosuppressalis(Walker) (Lepidoptera: Crambidae): Strong subdivision in China inferred from microsatellite markers and mtDNA gene sequences[J].MolecularEcology, 2008, 17(12): 2880-2897.

Peterson BK, Weber JN, Kay EH,etal. Double digest RADseq: An inexpensive method for de novo SNP discovery and genotyping in model and non-model species[J].PLoSOne,2012,7(5), e37135.

Pukk L, Ahmad F, Hasan S,etal. Less is more: Extreme genome complexity reduction with ddRAD using Ion Torrent semiconductor technology[J].MolecularEcologyResources, 2015, 15(5): 1145-52.

Rašic＇ G, Endersby NM, Williams C,etal. UsingWolbachia-based release for suppression ofAedesmosquitoes: Insights from genetic data and population simulations[J].EcologicalApplications, 2014, 24(5): 1226-1234.

Sheng CF, Wang HT, Sheng SY,etal. Pest status and loss assessment of crop damage caused by the rice borers,ChilosuppressalisandTryporyzaincertulasin China[J].EntomologicalKnowledge, 2003, 4: 289-294. [盛承发, 王红托, 盛世余, 等. 我国稻螟灾害的现状及损失估计[J]. 昆虫知识, 2003, 4: 289-294]

Wang GJ, ZhouB, Li YH. The RAD-tagged Sequencing and its application in molecular breeding[J].ChineseJournalofBiochemistryandMolecularBiology, 2012, 28(9): 797-803.[王冠杰, 周波, 李玉花. RAD标记测序及其在分子育种中的应用[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2012, 28(9): 797-803]

Wang YK, Hu Y, Zhang TZ. Current status and perspective of RAD-seq in genomic research[J].Hereditas, 2014, 36(1): 41-49.[王洋坤, 胡艳, 张天真. RAD-seq技术在基因组研究中的现状及展望[J]. 遗传, 2014, 36(1): 41-49]

式中SOC储为某一深度下的土壤有机碳储量，t/hm2；Ti为第i层的土壤有机碳含量，g/kg；ri为第i层的土壤容重，g/cm3；Hi为第i层的土壤厚度，cm；n为土壤层次。

Wei SJ, Li BY, Cao LJ,etal. RAD-seq and its application in entomological research[J].ActaEntomologicaSinica, 2016, 59(7): 767-774.[魏书军, 李冰艳, 曹利军，等. RAD-seq技术及其在昆虫学研究中的应用[J]. 昆虫学报, 2016, 59(7): 767-774]

Willing EM, Hoffmann M, Klein JD,etal. Paired-end RAD-seq for de novo assembly and marker design without available reference[J].Bioinformatics, 2011, 27(16): 2187-93.

Wu KM, Lu YH, Wang ZY. Advance in integrated pest management of crops in China[J].EntomologicalKnowledge, 2009, 46(6): 831-836.[吴孔明, 陆宴辉, 王振营. 我国农业害虫综合防治研究现状与展望[J]. 昆虫知识, 2009, 46(6): 831-836]

Zhai ZX. SNP Mapping and Population Genetic Analyses for 13 Chinese Indigenous Chicken Breeds Using RAD Sequencing[D].Shanghai Jiao Tong University,2014.[翟正晓. 基于RAD简化基因组测序技术的13种中国地方优良鸡品种SNPs多态性图谱构建及群体遗传学分析[D]. 上海交通大学, 2014]

Zhou Y, Yang Q, Han GJ,etal. Isolation of genomic microsatellite molecular marker by suppression-PCR inScirpophagaincertulas(Walker)[J].JiangsuJournalofAgriculturalSciences, 2013, 29(5): 999-1004.[周宇, 杨琼, 韩光杰, 等. 抑制PCR富集法分离三化螟基因组微卫星分子标记[J]. 江苏农业学报, 2013, 29(5): 999-1004]

Wang Y. Construction of High-Density Linkage Maps ofPopulusdeltoids×P.simoniiUsing Restriction-Site Associated DNA Sequencing[D]. Nanjing Forestry University, 2014. [王莹.利用RAD-seq测序构建美洲黑杨×小叶杨高密度遗传连锁图谱[D].南京林业大学, 2014]

Construction of genomic ddRADseq libraries ofChilosuppressalisandScirpophagaincertulas(Lepidoptera: Pyralidae)

YANG Qiong1*, SUN Na1, 2*, ZHENG Min1, LUO Chu-Cheng1, LUO Guang-Hua1**, FANG Ji-Chao1**

(1. Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 2100140, China; 2. College of Plant Protection, Nanjing Agriculture University, Nanjing 2100950, China)

We introduce a method of using two frequent cutter enzymes to construct restriction-site associated DNA sequencing (ddRADseq) libraries forChilosuppressalisandScirpophagaincertulas(Lepidoptera: Pyralidae). The fragment size distribution generated by a given pair of restriction endonucleases was estimated using Agilent 2100 Bioanalyzer. Based on Bioanalyzer analysis, we chose two frequent cutter enzymes (MluC I andNlaIII) for genomic DNA digestion. Each individual of stem borers was labelled with a unique combination of P1 and P2 barcodes. Size selection of adapter-ligated DNA fragments between 285-435 bp was performed using a Pippin Prep. Finally, size selected DNA was used as a template in PCR amplification. PCR primers will add a unique index sequence to all DNA fragments in the PCR reaction. Evaluation of the final libraries was performed using both routine agarose gel electrophoresis and Bioanalyzer. Both assessments showed that the molarity and fragment size distribution were appropriate for Illumina sequencing. This method confirms the feasibility of using a combination of restriction enzymes (MluC I andNlaIII) to construct the genomic ddRADseq libraries for the stem borers, which lays an important foundation for investigation into biogeography, population genetics and phylogenetics on rice stem borers.

gDNA library；ddRADseq；bioanalyzer；rice stem borer

国家水稻产业技术体系项目(CARS-01-25)；江苏省农业科技自主创新资金项目(CX(16)1001)；江苏省农业科学院院基金项目(6111606)

Received：2016-10-24；接受日期 Accepted：2016-11-08

Q963; S433

A

1674-0858(2016)06-1114-07

*共同第一作者简介：杨琼，博士，副研究员，研究方向为水稻虫害综合治理；孙娜，硕士研究生，研究方向为水稻虫害防控。