灯盏乙素抑制热应激诱导猪肾小管上皮细胞凋亡研究

丛霞，李华涛，陈健伟，张东君，曹荣峰，田文儒*

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2.肥城市畜牧兽医局，山东肥城 271600）

灯盏乙素抑制热应激诱导猪肾小管上皮细胞凋亡研究

丛霞1，李华涛1，陈健伟1，张东君2，曹荣峰1，田文儒1*

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2.肥城市畜牧兽医局，山东肥城 271600）

灯盏乙素（Scu）为灯盏花中提取的单一黄酮类化合物，具有清热解毒和保护细胞免受热应激损伤的作用。试验将不同浓度Suc培养的猪肾小管上皮细胞（LLC-PK1）在42℃下热应激1 h，采用RNA干扰法沉默细胞HSP72基因表达，荧光定量PCR和Western blot检测细胞热休克蛋白（HSP）70、Bcl-2、Bax、细胞色素C（Cyt-c）和caspase-3裂解。结果表明，Scu显著增加细胞Bcl-2蛋白和HSP70蛋白水平，增加Bcl-2/Bax比值，抑制Cyt-c的释放及pro-caspase-3裂解和caspase-3表达；但沉默HSP70后，细胞Cyt-c释放和caspase-3表达均显著增加。由此可知，Scu抑制LLC-PK1凋亡，保护细胞免受热应激损伤。

灯盏乙素；LLC-PK1；凋亡；热应激；HSP70

肾脏疾病如急性肾小管阻塞、慢性痛风性肾病、尿酸肾结石等，可引起肾脏组织损害，炎性细胞浸润，导致肾功能损伤。Choe等研究认为，细胞凋亡可能是肾脏（尤其是肾小管上皮）细胞损伤发病机制之一[1]。细胞凋亡具有两个主要调节途径，即死亡受体诱导的外源性和线粒体小体介导的内源性途径。Bax和Bcl-2在线粒体介导的凋亡途径中发挥重要作用，能调节线粒体外膜通透性，使细胞色素C（Cyt-c）释放到细胞质中。Cyt-c促进凋亡蛋白酶激活因子活化并激活caspase-9，促进procaspase-3裂解成caspase-3，导致蛋白水解和细胞凋亡[2]。在内源性途径中，HSP70能稳定部分变性蛋白，去除不可逆损伤蛋白，维持细胞正常功能并抑制热应激引起细胞凋亡。Bcl-2/Bax值是肾小管上皮细胞发生凋亡关键因素[3]。HSP70可阻止应激反应中Bax易位，抑制线粒体释放Cyt-c及caspase-3激活[4-5]。HSP70与线粒体释放的另一个凋亡诱导因子结合形成复合物，可阻止细胞染色质聚集和细胞凋亡[6]。

灯盏乙素（Scu）是灯盏花中提取的单一黄酮类化合物，在中医临床上广泛用于治疗心血管疾病[7]。Zhang等研究表明，Scu能抑制线粒体功能损伤和大脑缺血再灌注损伤所诱导的细胞凋亡[8]，通过上调Bcl-xL表达和降低caspase-3活性而抑制CoCl2诱导的PC12细胞凋亡[9]，Scu保护热应激诱导的细胞损伤研究报道鲜见，对Scu解热作用及机制研究较少。

本文采用RNA干扰、实时定量PCR和western blot方法，研究Scu对受热应激LLC-PK1细胞Bcl-2、Bax、HSP70、cyt-c和pro-caspase-3表达影响，为阐明Scu保护热应激引起细胞损伤的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料

猪肾小管上皮细胞（Pig kidney proximal tubular，LLC-PK1，美国ATCC细胞库第三代细胞）购自上海复祥生物科技有限公司；灯盏花乙素（Scutellarin，Scu）购自江西南昌制药工程中心；高糖DMEM培养基和胰蛋白酶购自美国GIBCO公司；胎牛血清购自美国HyClone公司；RNA提取试剂盒和反转录试剂盒分别购自原平皓生物有限公司和日本TaKaRa公司；LightCycler®480 SYBR GreenⅠMaster购自美国Roche公司；抗Bcl-2（sc-492）、Bax（sc-526），HSP70（sc-1060）、细胞色素C（sc-8385）、pro-caspase-3（ab90437）、caspase-3（ab13847）和GAPDH（sc-48166）抗体均购自美国Santa Cruze公司；兔抗羊、羊抗兔IgGHRP（二抗-辣根过氧化物酶）购自美国Jackson Immuno Research公司；Western及IP细胞裂解液、一抗二抗去除液和ECL荧光底物试剂盒均购自碧云天生物制品有限公司。

1.1.2 细胞培养及处理

LLC-PK1细胞在DMEM培养液中培养于37℃，含5%CO2培养箱中，DMEM培养液含5%胎牛血清并分别加入100 U·mL-1和100 μg·mL-1青、链霉素。将Scu溶解在DMSO中，使用时稀释终浓度为0.1%DMSO完全培养基。将细胞培养24 h后42℃热应激1 h处理，37℃下恢复6 h，收获细胞并作相应试验。

1.2 试验方法

1.2.1 Scu最佳浓度筛选

将LLC-PK1细胞（5×103·孔-1）接种于96孔培养板并培养24 h，再用含不同浓度Scu（10-3～10-7mol·L-1）完全培养基孵育24 h，CCK-8试剂盒检测细胞活力，具体操作方法参照试剂盒说明书。测定A450nm波长吸光度，取3次重复试验平均值。

1.2.2 siRNA干扰HSP70基因表达

将浓度为10 nm的HSP70干扰RNA（siRNAs，见表1）和QIAGEN转染试剂混合后，按照说明书操作程序转染细胞，转染细胞在37℃下培养12 h，42℃热应激1 h，然后在37℃下恢复6 h后收获细胞，Western blot法检测细胞HSP70表达水平，分析HSP70沉默效率，筛选最佳干扰RNA。

1.2.3 荧光定量PCR

按照RNA提取试剂盒说明，提取Scu和热应激处理细胞总RNA，按照试剂盒（TaKaRa）说明反转录，反应体系（20 μL）为：总RNA 7 μL；Random hexamer引物（0.2 μg·μL-1）1 μL；DEPC处理水4 μL；5×Reaction Buffer 4 μL；RibolockTMRNase抑制剂1 μL；10 mmol·L-1dNTP Mix 2 μL；M-MLV反转录酶1 μL。

将合成的cDNA产物作系列浓度梯度稀释，Roche LightCycler 480Ⅱ荧光定量PCR仪作定量反应，PCR反应体系（10 μL）为：ddH2O 3.6 μL；SYBRGreen Real time PCR Master Mix 5 μL；上下游引物（上海生工生物技术有限公司合成，20 pmol·μL-1）各0.2 μL（见表2）；cDNA 1 μL。PCR反应条件为：95℃10 min，95℃5 s，60℃30 s，72℃，30 s共45个循环。反应结束后，各组细胞以β-actin作内参基因，用2-ΔΔCt法定量分析[10]。

1.2.4 蛋白印迹分析

将细胞培养皿中培养液吸掉，加入2 mL PBS（0.01 moL·L-1，pH 7.2～7.3）清洗2次，去除PBS后将培养皿置于冰上，每培养皿细胞中加入0.5 mL终裂解液，吹打、混匀。裂解后将裂解液移至1.5 mL离心管中，4℃，14 000 r·min-1离心5 min。取离心后上清液用2×SDS样品缓冲液1∶1稀释，煮沸使蛋白变性。然后在5%浓缩胶、12%分离胶、电压为110 V条件下SDSPAGE电泳2 h。将细胞样品中蛋白质经电泳分离后，转移至PVDF膜上（4℃，220 mA，2 h），在TBST缓冲液中漂洗3次，每次5 min，将膜置于10%牛血清白蛋白（BSA）中室温封闭2 h，根据PVDF膜孔径加一抗（1∶1000稀释），4℃下孵育过夜，用TBST漂洗膜3次，每次5min；加入与一抗稀释后相同量的二抗IgG-HRP，室温反应1 h，经TBST漂洗3次，每次5 min，待ECL发光试剂显色后拍照鉴定，用BandScan 5.0软件灰度分析。

表1 试验中使用的siRNA核苷酸片段Table 1The primer sequences of siRNA used in the experiment

表2 荧光定量PCR引物Table 2The primer sequences used in real time PCR

1.2.5 统计分析

用SPSS 12.0软件作方差分析，试验数据用-X± SD表示，t检验做均数间比较，*表示差异显著（P＜0.05），**表示差异极显著（P＜0.01）。

2 结果与分析

2.1 Scu对细胞存活率影响

CCK-8法检测Scu检测处理后细胞活力，以确定Scu对LLC-PK1细胞毒副作用。结果发现，当Scu浓度为10-6～10-7mol·L-1时，对细胞存活率无显著（P＞0.05）影响（见图1），当Scu浓度增加至10-3～10-5mol·L-1时，细胞活力显著（P＜0.05）下降。

2.2 热应激对细胞凋亡相关因子表达影响

Western blot检测结果表明，与对照组比，热应激使细胞Bax和Bcl-2蛋白表达显著（P＜0.05）升高（见图2），使Bcl-2/Bax蛋白比值显著（P＜0.05）下降；此外，细胞受热应激后，cyt-c释放量和pro-caspase-3裂解量均显著（P＜0.05）高于对照组。

图1 不同浓度Scu对LLC-PK1细胞活力影响Fig.1Effects of different concentration of Scu on LLC-PK1 cells viability

图2 热应激对细胞Bcl-2、Bax、cyt-c、pro-caspase-3和caspase-3蛋白表达影响Fig.2Effects of heat stress on Bcl-2,Bax,cyt-c,pro-caspase-3 and caspase-3 protein expression

2.3 Scu对受热应激细胞Bcl-2、Bax及HSP70 mRNA表达影响

qRT-PCR检测结果显示，与热应激组比，Scu处理组（ScuM）细胞Bcl-2 mRNA表达显著（P＜0.05）升高（见表3），而Bax mRNA表达则显著（P＜0.05）降低（见表3），并且Bcl-2/Bax mRNA比值也显著（P＜0.05）升高（见表3）；值得注意的是，Scu（ScuM，P＜0.01；ScuL，P＜0.05）处理，比热应激组显著增加HSP70 mRNA表达，而当Scu浓度增加（ScuH）时，表达差异不显著（P＞0.05）（见表3）。

表3 Scu对热应激细胞Bcl-2、Bax及HSP70 mRNA表达水平影响Table 3Effects of Scu on Bcl-2,Bax and HSP70 mRNA expression

2.4 对热应激细胞Bcl-2、Bax及HSP70蛋白表达影响

Western blot检测结果（见图3）发现，与热应激组比较，Scu处理组（ScuM）细胞Bcl-2蛋白表达显著（P＜0.05）升高，而Bax蛋白表达则显著（P＜0.05）降低；Scu处理组（ScuM和ScuL）细胞Bcl-2/Bax蛋白比值以及HSP70蛋白和pro-caspase-3的表达量均显著升高，而cyt-c含量和caspase-3表达量则显著（P＜0.05）降低（见表4）。

2.5 siRNA对细胞热应激后HSP70表达抑制

Western blot检测发现，与热应激组比较，siRNA0、siRNA2、siRNA3和siRNA4组细胞HSP70蛋白表达均无显著差异，仅siRNA1组细胞HSP70蛋白表达极显著（P＜0.01）下降，抑制率为87.3%（见图4）。

2.6 沉默HSP70对Scu抗细胞凋亡相关蛋白表达影响

Western blot检测结果（见图5）显示，与单纯热应激组相比，转染siRNA组细胞cyt-c、procaspase-3和caspase-3蛋白表达均无显著（P＞0.05）变化；而Scu（ScuM）可显著（P＜0.05）抑制热应激诱导的cyt-c释放及pro-caspase-3裂解，显著（P＜0.05）降低caspase-3表达。沉默HSP70后，阻止Scu降低线粒体释放cyt-c作用，细胞质中cyt-c量显著（P＜0.05）升高；pro-caspase-3裂解显著（P＜0.05）升高；caspase-3表达显著（P＜0.05）升高。

图3 Scu对热应激细胞Bcl-2、Bax及HSP70蛋白表达影响Fig.3Effects of Scu on Bcl-2,Bax,cyt-c,pro-caspase-3, caspase-3 and HSP70 protein expression

表4 Scu对热应激细胞Bcl-2、Bax及HSP70蛋白表达的影响Table 4Effects of Scu on Bcl-2,Bax,cyt-c,pro-caspase-3,caspase-3 and HSP70 protein expression

图4 不同siRNA片段对细胞热应激后HSP70蛋白表达影响Fig.4Effect of different siRNA on relative amount of HSP70 protein expression

图5 沉默HSP70对Scu抗细胞凋亡相关蛋白表达的影响Fig.5Silence HSP70 affect expression of apoptotic relative proteins

3 讨论与结论

Bax和Bcl-2是重要细胞凋亡调节因子，其中Bcl-2是抗凋亡基因，Bax可抑制Bcl-2蛋白作用，其过度表达可促使细胞凋亡，Iwayama等研究认为，Bax通过与Bcl-2形成异源二聚体颉颃Bcl-2保护效应而促使细胞凋亡，Bcl-2和Bax蛋白比值决定细胞是否凋亡，Bcl-2/Bax值升高抑制细胞凋亡。因此，Bcl-2/Bax值是细胞凋亡阈值的关键因素[11]。本研究发现，热应激时Scu通过下调Bax并上调Bcl-2蛋白表达，提高Bcl-2/Bax值，表明Scu能缓解由热应激导致的细胞损伤，抑制LLC-PK1细胞凋亡。同时，热应激诱导LLC-PK1细胞释放Cyt-c，进一步激活caspase-9，使pro-caspase-3裂解成活化caspase-3，启动细胞凋亡。Caspase-3在细胞凋亡中发挥重要作用，是细胞凋亡主要效应执行者，一旦活化，凋亡不可逆转。Pro-caspase-3裂解激活caspase-3依赖于从线粒体中释放的cyt-c，激活的caspase-3可水解包括细胞调节、细胞信号转导、DNA修复、细胞存活等环节重要蛋白，使细胞表现为凋亡特有的形态学及生物化学特征。刘萍等研究发现，Scu可增加H2O2诱导的PC12 Bcl-2 mRNA表达，减弱caspase-3酶活性，降低P12细胞凋亡率[12]。徐华等研究证实，灯盏花素对顺铂肾毒性的保护作用机制与Bcl-2/Bax值相关[13]。说明Scu可通过提高Bcl-2表达，降低pro-caspase-3裂解水平发挥对细胞的保护作用。Hanqing C等研究发现，Scu对SAP大鼠肾小管细胞损伤具有明显保护作用[14]。本研究发现，一定浓度Scu可抑制LLC-PK1细胞Cyt-c的释放和caspase-3表达，原因是Scu改变细胞线粒体外膜通透性，抑制细胞色素C释放。本试验结果证实，Scu预处理可减少热应激诱导的LLCPK1细胞凋亡。

HSP70是机体在应激情况下迅速合成的蛋白质，被视为热应激过程中保护细胞的主要分子之一。HSP70能保护细胞免受高温损伤、提高细胞耐热性，HSP70可抑制凋亡小体形成，抑制细胞凋亡，提高细胞存活率。此外，HSP70还能直接保护H2O2和顺铂诱导的LLC-PK1细胞损伤[15]。热应激能够诱导LLC-PK1细胞高表达HSP70[16]。本研究发现，Scu能增加LLC-PK1细胞HSP70表达。这可能是Scu使细胞耐热，因为HSP70能修复应激损伤并恢复错误折叠蛋白[17]。本研究推测，Scu对细胞保护作用可能是由于：①Scu上调HSP70表达，修复细胞内变性Bcl-2蛋白，防止其被降解[18]；另一方面，HSP70过表达有效促进核仁素上调，稳定Bcl-2 mRNA表达[19]，促进Bcl-2表达，发挥凋亡抑制功能。②Scu上调HSP70表达，阻止Bax转移至线粒体[20]，使线粒体膜电位趋于稳定[21]，阻止cyt-c释放，抑制pro-caspase-3裂解，发挥细胞保护作用。

为证实Scu是否通过上调细胞HSP70表达起保护作用，本文用RNA干扰方法沉默HSP70表达，结果发现，单纯热应激诱导的HSP70表达不影响细胞线粒体释放Cyt-c及pro-caspase-3裂解，但沉默HSP70的表达可阻断Scu对细胞保护作用。说明Scu通过上调HSP70表达而对LLC-PK1细胞热应激损伤起保护作用。这可能是在氧化应激条件下，HSP70通过上调Bcl-2/Bax值，抑制线粒体膜电位改变，阻止cyt-c释放；此外，HSP70可与凋亡蛋白酶激活因子（Apaf-1）竞争性结合，抑制cyt-c与Apaf-1结合，阻止下游caspase-9激活caspase-3，最终阻止细胞凋亡。Liang等研究表明，细胞内钙离子增加可激活钙/钙调蛋白（CaM）和钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶II（CaMKII）信号通路[22]，进一步诱导HSP70表达[23-24]。增加细胞内钙离子水平可以诱导HSP70表达[25]。本研究发现，热应激时siRNA不能完全阻断Scu降低Cyt-c释放和procaspase-3裂解作用。然而，Scu可降低活性氧生成，抑制p38 MAPK活化[9]，防止Bax易位到线粒体及Cyt-c释放[26]。因此推测，Scu对LLC-PK1细胞保护作用还可能通过p38 MAPK信号转导通路，有效抑制热应激对LLC-PK1细胞的氧化及对细胞线粒体损伤实现，此亦有待深入研究的方向之一。

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Study on scutellarin attenuates heat stress-induced apoptosis in LLC-PK1 cells/

CONG Xia1,LI Huatao1,CHEN Jianwei1,ZHANG Dongjun2,CAO Rongfeng1,TIAN Wenru1(1.School of Animal Science and Veterinary Medicine,Qingdao Agricultural University, Qingdao Shandong 266109,China;2.Veterinary and Animal Husbandry Department Feicheng, Feicheng Shandong 271600,China)

Scutellarin(Scu)is known to abate fever in the clinical practice of Traditional Chinese Medicine.The primary cultured pig kidney proximal tubular(LLC-PK1)cells incubated with(or without) various concentrations of Scu were heat-stressed at 42℃for 1 h to make heat shock injury cellular model.RNAi technique was used to silence heat shock protein(HSP)70 mRNA expression.The HSP70,Bcl-2,Bax,cytochrome c(cyt-c)and pro-caspase-3 cleavage of the cells were all detected by using real-time PCR and Western blot aimed to examine the effects of Scu on heat-stressed LLC-PK1 cells and to explore its possible mechanism.The results showed that Scu significantly increased the levels of Bcl-2 and HSP70 protein,the ratio of Bcl-2 to Bax,and inhibited the release of cyt-c,procaspase-3 cleavage as well as caspase-3 expression.Interestingly,caspase-3 expression and release of cyt-c were dramatically increased in the cells with HSP70 RNA interference.These results demonstrate that Scu protects LLC-PK1 cells against heat stress,possibly by up-regulating HSP70 expression.

scutellarin;LLC-PK1;apoptosis;heat stress;HSP70

S853.72

A

1005-9369（2016）11-0059-07

时间2016-11-30 15:18:38[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20161130.1518.002.html

丛霞,李华涛,陈健伟,等.灯盏乙素抑制热应激诱导猪肾小管上皮细胞凋亡研究[J].东北农业大学学报,2016,47(11)：59-65

Cong Xia,Li Huatao,Chen Jianwei,et al.Study on scutellarin attenuates heat stress-induced apoptosis in LLC-PK1 cells [J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(11)：59-65.(in Chinese with English abstract)

2016-09-16

国家自然科学基金（31572590，31502138）；山东省自然科学基金（BS2015NY001）；山东省高等学校科技计划项目（J15LF03）

丛霞（1962-），女，高级实验师，硕士，研究方向为动物生殖生理与生殖疾病。E-mail:780010688@qq.com

*通讯作者：田文儒，教授，博士生导师，研究方向为动物生殖生理与生殖疾病。E-mail:wrtian@126.com