环氧化酶在炎症因子引起大鼠冠状动脉无复流中的作用机制研究

杨栋 焦其彬 张邢炜

环氧化酶在炎症因子引起大鼠冠状动脉无复流中的作用机制研究

杨栋 焦其彬 张邢炜

目的 探讨环氧化酶（COX）在炎症因子引起的大鼠冠状动脉无复流现象中的作用及机制。方法 采用结扎-放松冠状动脉左前降支法建立大鼠无复流模型，硫磺素S法测定离体大鼠左心室心肌无复流面积，根据左心室无复流面积将实验大鼠分为无复流组（＞20%）和对照组（≤20%），采用ELISA法测定两组大鼠血清C反应蛋白（CRP）和IL-6水平，real-time PCR法测定左心室COX1、2的RNA转录水平。另用吲哚美辛、0.9%氯化钠注射液（生理盐水）对无复流大鼠进行预处理，采用颈动脉插管法测定吲哚美辛组、生理盐水组及对照组大鼠心脏收缩舒张功能及无复流面积。结果 无复流大鼠血清CRP和IL-6水平较对照组升高，左心室COX1、2的RNA转录水平也高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），对照组大鼠心脏功能优于模型组，吲哚美辛组大鼠心室舒张末压低于模型组，而左室等容收缩期左心室内压力上升的最大速率和等容舒张期左心室压力下降的最大速率均较无复流模型组升高，吲哚美辛组无复流面积较模型组明显减少，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论 CRP、IL-6可能通过COX途径介导大鼠冠状动脉无复流现象，吲哚美辛能通过拮抗COX途径相关的炎症反应，改善大鼠冠状动脉的无复流。

环氧化酶 急性心肌梗死 无复流 炎症因子

经皮冠状动脉介入术（PCI）是治疗急性心肌梗死（AMI）的最重要手段之一。大规模临床研究业已证实，早期行PCI术能够挽救因心外膜血管物理阻塞而缺血的心肌，从而改善患者的近远期预后。然而PCI术后达到冠状动脉血流分级（TIMI）Ⅲ级的患者，犯罪血管虽已开通，但缺血心肌组织并没有完全、有效的血流灌注，发生冠状动脉“无复流（no-reflow）”。无复流在PCI术后的发生率为25%～30%左右，可显著提高充血性心力衰竭、恶性心律失常和心源性猝死的风险，增加住院病死率和心肌梗死发生率[1]，是短期病死率增加的独立预测因子[2]。因此，如何预测无复流、减少无复流的产生和尽快解决心肌缺血，成为急诊PCI亟待解决的难题。Rivera-Linares等[3]发现，CK-MB=160UI/L、KillipⅡ、TIMI血流0级、心电图上2个以上Q波、再灌注治疗方法和冠脉内是否存在血栓均是无复流发生的重要预测因子。临床观察研究提示炎症反应可能在冠脉无复流中发挥重要作用。本研究通过建立大鼠缺血再灌注模型，模拟临床无复流，使用环氧化酶（COX）途径阻断剂治疗，观察大鼠血清中炎症因子C反应蛋白（CRP）与IL-6水平、COX的RNA转录水平及心脏功能的变化，以探讨COX途径在炎症因子引起的大鼠冠状动脉无复流中的作用及机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 SD远交群雄性大鼠，购自南京君科生物工程有限公司，出生10～15周，体重270～330g，并随机编号。

1.2 试剂和抗体 10%水合氯醛，硫磺素S（40g/L），CRP及IL-6的ELISA试剂盒 (上海劲马实验设备有限公司)，TRIzol试剂（上海Invitrogen公司），PCR引物由上海Invitrogen公司合成，逆转录试剂盒（美国Thermo公司），SYBR Green real-time PCR Master Mix（美国ABI公司）。

1.3 主要仪器和用品 HX-300型动物呼吸机（成都泰盟科技有限公司），BIORAD680酶标仪（昆士兰生物有限公司），2-16K型离心机（Sigma公司），单通道心电图机（北京福田电子医疗仪器有限公司），ZF-1型紫外线分析仪（上海金鹏分析仪器有限公司），ABI 7300型PCR仪（美国ABI公司），5-0带针缝合线（上海医用缝合针厂有限公司）。

1.4 急性缺血再灌注模型建立 大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3ml/kg），麻醉成功后备皮，行气管切开术并连接小动物呼吸机（呼吸频率80次/min，呼吸比1∶1，潮气量20ml）。在左侧胸部心尖搏动最强的部位打开胸腔，撕开心包，于左心耳下2mm前降支根部穿入5-0的缝合线，在结扎线和冠状动脉之间垫一胶皮管，结扎冠状动脉。若心肌颜色变白，收缩运动不良、左心耳翘起，表明冠状动脉结扎成功。结扎60min后松解缝合线使结扎区域再灌注，15min后若结扎区心肌颜色变红、左心耳颜色由暗红变成鲜红，表明结扎的冠状动脉再通，急性缺血再灌注模型制作成功。

1.5 无复流模型建立及分组 大鼠心肌再灌注60min后，自下肢股静脉采血1ml，做好标记，并按1ml/kg注入硫磺素S，随即注入2%氯化钾溶液使心脏停跳，迅速取出心脏，用冰生理盐水冲洗心脏，切除心耳、大动脉、右室，保留左心室，在波长365nm下测定心肌梗死区（即无复流区）荧光信号，通过Image Pro.6.0处理，定义心肌无复流区面积＞20%的大鼠为无复流组（9只），≤20%的大鼠为对照组（11只），将左心室标本洗净，-80℃冻存。

1.6 血清CRP和IL-6水平测定 采用ELISA法。所采静脉血室温自然凝固10min后，3 000r/min离心20min，取上层血清置于密封管中，-80℃冷冻保存待检。按照试剂盒说明书操作测定大鼠血清CRP和IL-6水平。

1.7 COX1和COX2 RNA转录水平测定 采用realtime PCR法。取出-80℃保存的左心室标本200mg左右，加入液氮，在研钵中研碎，分置于1.5ml的离心管中，用Trizol反复吹打，静置5min。按照TRIzol Reagent操作手册步骤提取细胞总RNA，加入适量的RNasefree水溶解沉淀，保存于-80℃。Nanodrap2000检测RNA浓度及纯度。按M-MLV逆转录酶及M-MLV cDNA合成试剂盒说明书进行，将各组RNA逆转录为cDNA作为模板。采用SYBR Green PCR Master Mix荧光染料嵌合法在ABI 7300定量PCR仪上进行检测。PCR反应体系为：SYBR Green PCR Master Mix 10μl；Primer F/R（10μmol·L-1） 1μl；cDNA 2μl，加双蒸水至20μl。反应条件：95℃30s 1个循环；95℃5s、60℃31s 40个循环；95℃15s、60℃60s、95℃15s 1个循环。采用2-ΔΔct法计算COX1和COX2 RNA的相对表达量。

1.8 心功能测定 再次依上法制作大鼠冠状动脉无复流模型25只并予随机编号，其中10只术前30min腹腔注射吲哚美辛（5mg/kg），15只注射等量0.9%氯化钠注射液。备皮，消毒颈前区，沿正中线剪开皮肤，分离暴露右侧颈动脉，止血夹颈夹闭颈动脉近心端，远端完全丝线结扎，在止血夹与丝线中点作颈动脉斜切口，插入测压导管，松开止血夹，当遇到阻力时停下，待心脏收缩时插入左心室，连接多导电生理仪，记录左心室舒张末期压力（LVEDP），计算等容收缩期左心室内压力上升的最大速率（dp/dt）和等容舒张期左心室压力下降的最大速率（-dp/dt）。然后注入2%氯化钾溶液，同前测定心肌梗死区荧光信号，计算心肌无复流区面积并进行分组。将注射吲哚美辛大鼠中心肌无复流区面积＞20%且面积排位在前的6只作为吲哚美辛组；注射氯化钠大鼠中心肌无复流区面积＞20%且面积排位在前的6只作为模型组，面积≤20%的6只作为对照组。实验过程中吲哚美辛组1只大鼠死于恶性心律失常，余大鼠完成实验。

1.9 统计学处理 采用SPSS20.0统计软件。计量资料以表示，两组间比较采用成组资料t检验；多个样本均数比较采用方差分析，两两比较采用SNK-q检验。

2 结果

2.1 无复流组与对照组大鼠血清CRP和IL-6水平的比较 无复流组大鼠血清CRP水平为对照组的2.4倍 [（322.64±22.58）μg/ml比（134.33±13.32）μg/ml]，差异有统计学意义（P＜0.01）；无复流组大鼠IL-6水平也高于对照组[（141.10±21.23）pg/ml比（102.05±17.81）pg/ml]，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 无复流组与对照组大鼠心肌COX1和COX2 RNA转录水平比较 无复流组大鼠左心室心肌COX1的RNA转录水平较对照组明显上调（1.7∶1），COX2转录水平较对照组也明显上调（3.68∶1），差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.3 吲哚美辛组﹑无复流模型组和对照组大鼠心脏功能的比较 见表1。

表1 吲哚美辛组、无复流模型组和对照组大鼠心脏功能比较

由表1可见，无复流模型组大鼠LVEDP显著高于对照组，HR﹑dp/dt和-dp/dt均显著低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；吲哚美辛组大鼠LVEDP显著低于对照组，HR﹑dp/dt和-dp/dt均显著高于无复流模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

3 讨论

冠状动脉无复流现象因其在AMI再灌注治疗后高发，引起临床上的广泛关注。无复流现象一旦发生，如不及时处理可长期存在。无复流现象对AMI患者的心肌缺血区血流改善、心脏收缩舒张功能均会产生不良影响，影响患者PCI手术效果及预后。无复流的产生和发展机制十分复杂，目前主要有:内皮细胞损伤、白细胞激活、氧自由基介导的微血管损伤、微血栓、斑块碎片等[4]。在这些无复流机制理论中，炎症因子贯穿于心肌细胞损伤的全过程，且能够渗透到其他损伤因素中发挥作用，是十分活跃的中介因子。Li等[5]发现脂质体前列腺素E1（Lipo-PGE1）能够缩小心肌梗死再灌注小型猪模型无复流区域，减轻炎症反应和无复流现象，保护受损心肌。因此，炎症反应在AMI患者PCI术后无复流发生中占有重要地位。

临床研究发现，急诊PCI术后无复流患者，血清CRP等炎症因子水平明显升高，提示冠状动脉无复流的产生可能与炎症反应密切相关[6-7]。本研究通过构建大鼠冠状动脉无复流模型，发现无复流组大鼠血清CRP和IL-6水平较对照组明显升高，提示炎症反应可能在冠状动脉无复流中发挥重要作用。因而，术前对AMI患者行炎症因子测定，或许可以预测无复流的产生。本研究中，冠状动脉无复流大鼠左心室COX1和COX2的RNA转录水平较对照组升高，提示CRP等炎症因子可能通过上调COX1和COX2基因表达，诱发血管内皮细胞炎症，从而引起PCI术后无复流现象发生。吲哚美辛为临床常用非甾体抗炎药，通过阻断COX2发挥消炎止痛的作用。本研究发现，对无复流大鼠行腹腔注射吲哚美辛后，其心肌无复流面积及左室舒张收缩功能较无复流模型组大鼠有显著改善，提示吲哚美辛可能通过阻断COX2途径改善大鼠心肌无复流情况。

炎症是临床最为常见、最为重要的基本病理过程，诸多疾病的发生、发展都与之密切相关。参与炎症反应的因子数量繁多，通路机制错综复杂，是临床观察和基础研究经久不衰的热点话题。非甾体抗炎药可以通过抑制COX2的活性﹑减少前列腺素合成来减轻炎性反应；还可以通过抑制磷酸二酯酶（PDE）活性来提高细胞内cAMP浓度，从而稳定溶酶体膜，减少溶酶体的释放，从而抑制炎症反应。近年来，炎症因子与冠状动脉PCI术后无复流的关系日益密切；多项研究证实，抑制炎症因子活性能够减轻无复流，从而保护心脏[4,8]。本研究中，对无复流大鼠应用COX2阻断剂后，LVEDP﹑dp/ dt和-dp/dt较模型组大鼠均有显著改善，提示吲哚美辛能够改善无复流大鼠心脏舒张收缩功能，证明对炎症通路的阻断能够改善大鼠冠状动脉无复流情况，增加心肌梗死后大鼠梗死区心肌血供，从而保护梗死区心肌细胞，改善预后。

综上所述，CRP、IL-6血清浓度有可能是AMI患者PCI术后是否发生无复流的重要预测指标，也可能成为判断AMI患者预后的重要指标。如何降低AMI患者PCI术前血清CRP浓度，下调COX途径激活水平，减轻冠状动脉血管内皮细胞损伤，从而降低无复流发生概率，提高PCI成功率，改善患者远期预后，可能是今后心血管病研究的重要方向。以非甾体类抗炎药为代表的抗炎药物，可能通过阻断或抑制炎症相关途径，减轻血管内皮炎症，降低冠状动脉无复流的发生，从而改善AMI患者PCI术后心脏血流和临床预后。

[1] Morishima I,Sone T,Okumura K,et al.Angiographic no-reflow phenomenon as a predictor ofadverse long-term outcome in patients treated with percutaneous transluminalcoronary angioplasty for first acute myocardialinfarction[J].J Am CollCardiol,2000,36 (4):1202-1209.

[2] Choo E H,Kim P J,Chang K,et al.The impact of no-reflow phenomena after primary percutaneouscoronary intervention:a time-dependent analysis of mortality[J].Coron Artery Dis,2014,25 (5):392-398.

[3] Rivera-Linares B M,Bedolla-Barajas M,Morales-Romero J,et al. [Predictors of no-reflow phenomenon after primary percutaneous coronary intervention][J].Rev Med Inst Mex Seguro Soc,2014,52 (5):522-529.

[4] Shao L,Zhang Y,Ma A,et al.Atorvastatin preconditioning improves the forward blood flow in the no-reflow rats[J].Fundam Clin Pharmacol,2014,28(1):42-52.

[5] Li J H,Yang P,Li A L,et al.Cardioprotective effect of liposomal prostaglandin E1 on a porcine model of myocardial infarction reperfusion no-reflow[J].J Zhejiang Univ Sci B,2011,12(8):638-643.

[6] Zhao XJ,Liu XL,He G X,et al.Effects ofsingle-dose atorvastatin on interleukin-6,interferon gamma,and myocardialno-reflow in a rabbit model of acute myocardial infarction and reperfusion[J]. Braz J Med BiolRes,2014,47(3):245-251.

[7] Dong M,Mu N,Ren F,et al.Prospective study of effects of endogenous estrogenson myocardial no-reflow risk in postmenopausal women with acute myocardial infarction[J].J Interv Cardiol,2014,27(5):437-443.

[8] Zeng M,Yan H,Chen Y,et al.Suppression of NF-kappaB reduces myocardialno-reflow[J].PLoS One,2012,7(10):e47306.

Effect of cyclooxygenase on no-reflow phenomenon in acute myocardial infarction of rats

YANG Dong,JIAO Qibin,ZHANG Xingwei.Department of Cardiovascular Diseases，the Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University，Hangzhou 310011，China

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of cyclooxygenase(COX)on no-reflow phenomenon in acute myocardial infarction(AMI). Methods Acute myocardial infarction was induced by ligation and reperfusion of the left anterior descending coronary artery(LAD)in Sprague Dawley(SD)rats.Thioflavin S was injected for the measurement of the no-reflow area in the left ventricle of rats;then the rats were divided into the no-reflow group and the normal-reflow group.The serum levels of C-reactive protein(CRP)and interleukin(IL)-6 were determined by ELISA after the operation.Real-time PCR was used to detect the transcription levels of the COX1,2 in left ventricle.Indometacin was used to block cyclo-oxygenase-2 pathway.The heart rate (HR),left ventricular end diastolic pressure(LVEDP),positive and negative peak first derivative(±dp/dt max)were measured through carotid artery intubation by the end of balanced perfusion. Results Serum CRP and IL-6 levels in no-reflow group were significantly higher than those in normal-reflow group(both P＜0.05).The expressions of COX1,2 in left ventricle were elevated in no-reflow group compared to normal-reflow group (both P＜0.05).The heart functions of no-reflow group were decreased compared to normal-reflow group.LVEDP in no-reflow group was higher than that in normal-reflow group.Moreover,HR and± dp/dt were significantly decreased in no-reflow group.With indometacin injection LVEDP and±dp/dt of no-reflow group were significantly improved (all P＜0.05). Conclusion Inflammatory factors CRP and IL-6 may be involved in the no-reflow phenomenon of AMI,which may be associated with the effect of cyclooxygenase.Indometacin can block the COX pathway and decrease the no-reflow in AMIofrats.

Cyclo-oxygenase Acute myocardium infarction No-reflow phenomenon Inflammatory factor

2015-10-15）

（本文编辑：沈叔洪）

浙江省科技厅科技计划（2008C30039）；杭州市科技局医学重点专科专病项目（20090833Q08）；浙江省自然科学基金资助项目（Y2111051）

310011 杭州师范大学附属医院心内科

张邢炜，E-mail：hsdzxw@126.com