W n t／ －Ca te n in信号通路在非酒精性脂肪肝发病中的作用及阿托伐他汀的干预效果

田卫东

（湖北省武汉市江夏区疾病预防控制中心，湖北 武汉 430200）

W n t／ －Ca te n in信号通路在非酒精性脂肪肝发病中的作用及阿托伐他汀的干预效果

田卫东

（湖北省武汉市江夏区疾病预防控制中心，湖北 武汉 430200）

目的 探讨大鼠非酒精性脂肪肝的发病机制及阿托伐他汀的干预改善作用。方法 将60只清洁级SD大鼠随机分为正常对照组、非酒精性脂肪肝模型组和阿托伐他汀治疗高、中、低剂量组，各12只。高脂高糖饮食复制非酒精性脂肪肝模型，药物治疗组大鼠第12周开始接受阿托伐他汀灌胃治疗，模型组和正常对照组给予等剂量的溶剂羧甲基纤维素钠（CMC－Na）。分析各组大鼠血清天门冬酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）及超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平，并检测基质金属蛋白酶(MMPs)和 Wnt／ －Catenin通路蛋白的表达，HE染色分析肝脏组织病理变化。结果 与正常对照组相比，高脂饮食模型组大鼠血清TG，TC，AST，ALT水平明显升高，羟脯氨酸含量增高，MMP2，MMP9，Wnt1，Wnt4， －Caternin表达明显增强；而阿托伐他汀可显著改善上述异常，且具有剂量依赖性。结论 阿托伐他汀能通过抑制 Wnt／ －Catenin信号通路改善大鼠非酒精性脂肪肝肝脏损伤。

非酒精性脂肪肝；阿托伐他汀；Wnt／ －Catenin信号通路；羟脯氨酸；剂量依赖性

随着生活方式及饮食结构的改变，非酒精性脂肪肝的发病率有逐年升高趋势，且严重影响患者的生活质量[1－2]。非酒精性脂肪肝的发病与多种因素有关，如血脂代谢紊乱、糖尿病及病毒感染等[3－6]，但确切机制尚不明确。Wnt／β－Catenin信号转导通路普遍存在于各种病理模型和疾病过程中，且是多种药物治疗的关键作用靶点。阿托伐他汀是临床常用的调脂类药物，能明显降低患者的心血管事件，对冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)、糖尿病、高血压和高血脂患者具有显著疗效，且无明显不良反应。阿托伐他汀能通过显著的抗炎作用和降低血清三酰甘油(TG)和总胆固醇(TC)水平改善动脉粥样硬化症状[7]。本研究中通过高脂饮食诱导大鼠非酒精性脂肪肝模型，探讨Wnt／β－Catenin信号转导通路在大鼠非酒精性脂肪肝的发病机制中的作用及阿托伐他汀的治疗作用，为酒精性脂肪肝的临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1．1 仪器、动物及试剂

Real－time PCR仪（美国ABI公司）；引物（上海生工合成有限公司）；PCR试剂盒（北京天根生物有限责任公司）；电泳仪（美国UVP公司）；凝胶成像仪（美国UVP公司）；半干式电转槽（北京六一仪器厂）。血脂三酰甘油（批号为20120905）、总胆固醇（批号为20131016），丙氨酸氨基转移酶（ALT，批号为20130608）和天门冬酸氨基转移酶（AST，批号为20120609）及羟脯氨酸测定试剂盒（批号为20130609），均购自南京建成生物工程研究中心；兔抗大鼠 Wnt1（sc－21085）、Wnt4（sc－33871）和β－Caternin（sc－77902）均购自美国Santa Cruz公司；二抗购自武汉博士德生物有限公司；其余试剂均为市售分析纯。60只清洁级SD大鼠购自上海斯莱克实验动物中心，雌雄不拘，许可证号SCXK（沪）2008－0003，大鼠体重210～230 g。适应性饲养7 d，期间自由饮食。保持房间温度25℃，相对湿度50%。

1．2 方法

分组及给药方法：将60只SD大鼠随机分为正常对照组、非酒精性脂肪肝模型组(模型组)和阿托伐他汀治疗组(治疗组)，各12只。对照组大鼠每天给予基础饲料[36%玉米、23%小麦、10%麸皮、12%豆粕、3%鸡蛋、12%鱼粉、2%酵母粉、1%盐（50 kg饲料中含碳酸氢钙和多维微量元素各150 g）]喂养，其余各组均给予高脂饲料（74．5%基础饲料、10%糖、10%猪油、5%蛋黄粉）喂养，持续36周。从第12周开始，治疗组大鼠灌胃给予阿托伐他汀钙片（辉瑞制药有限公司，国药准字J20030048，规格为每片20mg）治疗，低剂量组2mg／kg，中剂量组20mg／kg，高剂量组100 mg／kg；对照组和高脂饮食模型组给予等剂量的溶剂(羧甲基纤维素钠)灌胃。试验结束后，颈总动脉放血处死大鼠，取血清和肝脏组织，待用。

血清分离及生化测定：大鼠提前1 d禁食，麻醉后，颈总动脉取血处死。分离血液，静置15min后，3 000 r／min离心15 min分离上层血清，－20℃保存备用。TG，TC，ALT，AST生化测定及肝脏中羟脯氨酸水平测定均严格遵照试剂盒说明书进行。

肝脏病理改变分析：各组大鼠颈动脉放血处死后取肝脏左叶，用10%中性甲醛固定，自来水冲洗后，经乙醇逐级脱水，二甲苯透明后进行石蜡包埋、切片，制备4～5μm的石蜡切片。常规苏木精－伊红（HE）染色，分析肝脏组织的病理改变。

酶联免疫吸附（ELISA）法检测Wnt／β－Catenin信号转导通路关键蛋白表达：采用BCA法对各组大鼠肝脏组织提取后的总蛋白定量。以等量总蛋白行ELISA法检测。所有操作均严格按说明书进行，以β－actin作为参照进行靶点蛋白表达的定量分析。

1．3 统计学处理

2 结果

2．1 一般状况

在整个试验过程中，大鼠均无死亡发生，各组大鼠的体重均有增加，但模型组大鼠毛发光泽变暗，且表现为行动迟缓，而治疗组大鼠的毛色光泽好于模型组，且行动较模型组迅速。

2．2 肝脏病理学异常

与对照组比较，模型组大鼠肝脏组织炎性细胞增多，细胞肿大，部分区域出现气泡样结构，且有部分坏死部位；阿托伐他汀高剂量组大鼠的肝脏组织无明显病理改变。见图1。

图1 非酒精性脂肪肝大鼠肝脏病理学变化显微图(HE染色)

2．3 肝脏组织羟脯氨酸水平

模型组大鼠肝脏组织中的羟脯氨酸水平显著高于对照组大鼠（P＜0．01）；阿托伐他汀治疗各组大鼠肝脏组织的羟脯氨酸水平比模型组有所下降，且中剂量组和高剂量组明显低于模型组（P＜0．01和 P＜0．05）。见图2。

图2 非酒精性脂肪肝大鼠肝脏组织羟脯氨酸水平变化

2．4 血清血脂水平

模型组大鼠血清中TG，TC，LDL水平明显高于对照组，而 HDL水平明显低于对照组（P＜0．01）；同时，阿托伐他汀能明显抑制血脂指标的异常（P＜0．01，P＜0．05）。见表1。

表1 各组大鼠血清血脂水平变化比较（s，mmol／L，n＝12）

表1 各组大鼠血清血脂水平变化比较（s，mmol／L，n＝12）

注：与对照组相比， P＜0．01；与模型组相比，＃P＜0．05，P＜0．01。下表同。

指标TG TC LDL HDL对照组0．76±0．03 1．69±0．12 1．09±0．05 0．46±0．02模型组0．99±0．11 2．22±0．14 1．99±0．12 0．11±0．03低剂量组0．97±0．13 2．18±0．09＃1．89±0．06＃0．13±0．04中剂量组0．90±0．08＃1．87±0．16 1．70±0．13＃0．19±0．05高剂量组0．81±0．10 1．80±0．14 1．65±0．21 0．28±0．06＃

2．5 血清转氨酶水平

模型组大鼠血清中丙二醛（MDA）、ALT，AST水平明显高于正常对照组，而超氧化物歧化酶（SOD）水平明显低于对照组（P＜0．01）；同时，阿托伐他汀能明显抑制上述转氨酶和SOD及MDA的异常（P＜0．01和 P＜0．05）。见表2。

表2 各组大鼠血清转氨酶水平变化比较（s，n＝12）

表2 各组大鼠血清转氨酶水平变化比较（s，n＝12）

组别对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组ALT（U／L）19．5±4．22 30．9±3．71 30．1±5．53 28．9±4．08＃23．7±3．76 AST（U／L）55．9±8．12 69．3±6．79 67．8±4．56＃60．1±5．72 58．6±1．14 SOD（U／mL）141．9±10．5 109．1±9．2 118．9±12．8＃127．6±7．3＃136．5±10．1 MDA（nmol／L）5．16±1．02 8．31±1．13 8．19±1．25＃7．77±1．42 7．28±0．99＃

2．6 肝脏组织基质金属蛋白酶(MM Ps)表达水平

模型组大鼠肝脏组织中MMP2和MMP9的表达明显高于对照组（P＜0．01）；同时，阿托伐他汀能明显抑制上述蛋白表达的异常（P＜0．01和P＜0．05）。见图3。

图3 非酒精性脂肪肝大鼠肝脏组织MMPS表达水平变化

2．7 肝脏组织W nt及 －Catenin表达

模型组大鼠肝脏组织中 Wnt1，Wnt4，β－Catenin表达明显高于对照组（P＜0．01）；阿托伐他汀组大鼠上述升高表达的蛋白被明显抑制，且具有剂量依赖性（P＜0．01和 P＜0．05）。见表3。

3 讨论

脂肪肝是临床最常见的肝脏疾病，主要由肝细胞内脂肪过度积累引起，已成为继病毒感染之后的第二大肝脏疾病，严重影响患者的生活状态和生存质量。非酒精性脂肪肝病的发病原因有多种，但其确切发病机制尚未完全阐明。

表3 各组大鼠肝脏组织Wnt及 －Catenin表达变化比较（s，n＝12）

表3 各组大鼠肝脏组织Wnt及 －Catenin表达变化比较（s，n＝12）

组别对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组Wnt1／ －actin 0．25±0．02 0．87±0．11 0．80±0．14＃0．75±0．08 0．70±0．11 Wnt4／ －actin 0．19±0．02 0．79±0．06 0．72±0．16＃0．58±0．22 0．36±0．14－Catenin／ －actin 0．39±0．11 0．98±0．22 0．92±0．06＃0．76±0．17＃0．65±0．27

Wnt／β－Catenin信号通路与肝脏多种疾病的发病及恶化过程密切相关[8－9]。在研究鳖甲煎丸对肝细胞癌中Wnt／β－Catenin信号通路及抑制基因DKK－1与FrpHe表达影响的研究中发现，药物能明显抑制肝癌细胞的增殖及黏附和转移过程，同时也明显抑制肝癌细胞中β－Catenin蛋白的表达，表明鳖甲煎丸抑制肿瘤细胞增殖主要依靠调节Wnt／β－Catenin信号通路[10]。在分析肝细胞肝癌中 Wnt5a，β－Catenin，E－cadherin蛋白的表达及临床意义中也发现，Wnt5a的表达与肝癌的临床分期和预后有明显的负相关性，且在肿瘤组织中可能发挥抑癌基因的作用[11]。本研究结果显示，非酒精性脂肪肝大鼠肝脏组织中Wnt1，Wnt4，β－Catenin表达明显高于正常对照组大鼠（P＜0．01）；治疗组大鼠上述升高表达的蛋白被明显抑制，且具有剂量依赖性，表明Wnt／β－Catenin信号通路也参与了非酒精性脂肪肝的发病过程。

基质金属蛋白酶家族是肝脏正常代谢过程必不可少的酶，也是肝脏多种病理过程的关键蛋白酶。在分析扛板归对二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化大鼠肝组织基质金属蛋白酶及MMP1表达影响的研究中证实，扛板归具有明显的抗肝脏纤维化作用，且主要作用机制是提高MMP1和抑制TIMP1蛋白的表达[12]。在分析清肝活血方对酒精性肝纤维化大鼠基质金属蛋白酶调控作用的研究中也发现，酒精性脂肪肝肝脏组织中存在基质金属蛋白酶及其抑制剂MMP2，MMP9，TIMP1的异常表达，而清肝活血方主要通过调节肝脏组织中异常的基质金属蛋白酶及其抑制剂达到改善酒精性脂肪肝肝脏异常的作用[13]。本研究中在分析非酒精性脂肪肝大鼠肝脏组织基质金属蛋白酶水平变化及药物干预作用时也发现，模型组大鼠肝脏组织中MMP2和MMP9的表达明显高于对照组；同时，阿托伐他汀能明显抑制上述蛋白表达的异常，提示基质金属蛋白酶异常参与了高糖高脂饮食复制的非酒精性脂肪肝大鼠模型，而阿托伐他汀能调节上述蛋白的异常，从而发挥改善肝脏损伤的作用。

综上所述，阿托伐他汀能通过抑制Wnt／β－Catenin信号通路改善大鼠非酒精性脂肪肝肝脏损伤。

作者简介：田卫东（1969－），男，汉族，大学本科，副主任医师，研究方向为消化系统疾病诊治，（电子信箱）541886467＠qq．com。

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Role and Intervention Effect of Atorvastatin A lleviating Liver Dam age in Non－A lcoholic Fatty Liver Disease of Rats by Inhibiting the Activated W nt／β－Catenin Singling Pathway

Tian Weidong
（Jiangxia Center for Disease Control and Prevention，Wuhan，Hubei，China 430200）

Ob jective To investigate the effect and mechanism of atovastatin on non－alcoholic fatty liver disease（NAFLD）．M ethods 60 clean SD rats were divided into 5 groups，control，NAFLD group and atovastatin groups at low，medium and high dose treatment，12 rats in each group．The NAFLD rats were duplicated by high glucose and fatty diets．The atorastatin group was giuen atovastatin gavage, and the control group and NAFLD group were given CMC－Na gavage with the same amount．The content of serum AST，ALT，TG，TC，SOD and MDA were assayed in each group．The expression of MMPs and Wnt／β－Catenin pathway members were detected by ELISA．The pathological changes of liver tissue were analyzed by HE staining．Results The results showed that the contents of AST，ALT，TG，TC，LDL were increased in NAFLD rats while the HDL concentration was decreased when compared with control．The results also revealed that MMP2，MMP9，Wnt1，Wnt4 as well asβ－Catenin was up－regulated dramatically when compared with the control group．Atovastatin treatment can relieve those aforementioned parameters dramatically with dosage dependence．Conclusion Activated Wnt／β－Catenin is participated in the pathogenesis of NAFLD and atovastatin exerts its effect mainly by inhibiting this pathway．

non－alcoholic fatty liver disease；atovastatin；Wnt／β－Catenin signaling pathway；hydroxyproline；dose dependent manner

R965；R972＋．6

A

1006－4931(2016)04－0051－04

2015－07－28；

2015－10－12)