MT1-MMP在病毒性心肌炎小鼠中的表达及三七总皂甙的干预作用

荣星 吴婷婷 夏天和 吴蓉洲 陈其

MT1-MMP在病毒性心肌炎小鼠中的表达及三七总皂甙的干预作用

荣星 吴婷婷 夏天和 吴蓉洲 陈其

目的 观察膜型基质金属蛋白酶-1（MT1-MMP）在病毒性心肌炎小鼠中的表达及意义。方法 选用近交系4～6周龄雄性BALB/C小鼠，采用随机数字表法分为3组：空白对照组、心肌炎组、治疗组。于病毒接种后第8、15、21天分别采血后处死小鼠并留取心脏标本。分别采用RT-PCR法及免疫组化法检测心肌MT1-MMP的mRNA及蛋白表达，光镜观察心肌组织病理改变。结果 心肌炎组和治疗组各时间点心肌细胞MT1-MMP的mRNA含量明显高于空白对照组（P＜0.01），治疗组在第15、21天明显低于心肌炎组（P＜0.05或0.01）；心肌炎组和治疗组各时间点心肌细胞MT1-MMP免疫组化染色呈强阳性表达，空白对照组呈弱阳性。与心肌炎组比较，治疗组心肌细胞MT1-MMP表达在第15、21天降低，差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）。结论 MT1-MMP可能参与了病毒性心肌炎小鼠的发病，中药三七总皂甙可能通过降低MT1-MMP的表达起治疗作用。

病毒性心肌炎 膜型基质金属蛋白酶-1 三七总皂甙 小鼠

病毒性心肌炎是儿童较常见的感染性心肌疾病之一，除暴发性心肌炎外大多预后较好，但治疗不及时，仍有一部分可导致慢性心肌炎甚至扩张型心肌病，因此受到临床重视。基质金属蛋白酶（MMPs）是一类具有降解几乎所有细胞外基质为主要功能的内源性蛋白水解酶，研究表明，MMP-2、MMP-9和MMP-12在病毒性心肌炎中表达明显升高，推断CVB3感染后细胞外基质（ECM）的重塑与MMPs表达和活性增强有关。膜型基质金属蛋白酶-1（MT1-MMP）的作用有别于其他MMPs，其可能促进心肌纤维化的形成[1]。本文旨在探讨病毒性心肌炎小鼠使用三七总皂甙进行干预后心脏组织MT1-MMP表达含量的变化，探讨MT1-MMP在病毒性心肌炎中可能的作用机制，现报道如下。

1 实验动物和方法

1.1 实验动物及分组 近交系4～6周龄雄性Balb/c小鼠68只，购自于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号SCXK2003-0003。三七总皂甙（商品名：血塞通注射液，国药准字号Z53020134）购于云南植物药液有限公司。CVB3病毒Nancy标准株购自于山东省医学科学院病毒室，在Hep-2细胞上传代，冻融3次离心后留取上清液，测组织培养半数感染量（TCID50）为10-4.36。将小鼠按随机数字表法分为3组，空白对照8只，心肌炎组30只，治疗组30只。空白对照组于第0天每只小鼠腹腔注射不含病毒的1640培养液0.1ml，心肌炎组和治疗组在第0天每只小鼠腹腔注射0.1ml 10-4.36TCID50/ml的CVB3复制心肌炎模型，然后心肌炎组分别腹腔注射0.1ml 0.9%氯化钠溶液，1次/d，治疗组按180mg/kg的剂量腹腔内注射三七总皂甙注射液，1次/d，于第8、15、21天心肌炎组及治疗组小鼠分别按随机数字表法抽取8只，空白对照组（8只）在第21天小鼠眼球取血后用颈椎脱臼的方法处死并留取心脏标本。

1.2 方法

1.2.1 心肌HE染色与炎症积分 （1）HE标本制作及观察：小鼠心脏取出后快速放入预冷的含4%多聚甲醛小瓶中固定，常规石蜡包埋切片，厚约4μm，进行HE染色，光镜下观察心肌的病理变化。（2）炎症积分参照Rezkalla方法计分[2]，即每张切片随机取5个视野，计算每个视野区域炎症细胞浸润及坏死区域面积与整个视野的面积之比：无病变0分，≤25%计1分，≤50%计2分，≤75%计3分，＞75%计4分。

1.2.2 半定量RT-PCR检测心肌MT1-MMP mRNA含量 取左心室心尖心肌组织在液氮环境下研成粉末，采用TRIZOL（美国Life公司）一步抽提法提取总RNA，逆转录反应体系25μl，含RNA 2μg，随机引物1μl，DEPC 5μl，RNA酶抑制剂0.5μl，10mmol/L dNTPs 1.25μl，MMLV200 U（1μl），5×反应缓冲液5μl，37℃反应60min，将RNA逆转录为cDNA。PCR扩增反应体系20μl含：cDNA2μl，10mmol/LdNTPs 0.5μl，Taq 1μl（3U），10×反应缓冲液2μl，25mmol/L MgCl 2 1.2μl，MT1-MMP上下游引物各1μl（20pmol）。每一PCR循环包括95℃变性1min，60℃退火45s，72℃延伸1.5min，30个循环后继续72℃延伸7min。PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳（180V）后，银染，用ImagemasterVDS成像系统摄影存盘后，应用计算机图像分析软件（TolallabV101）行光密度值扫描分析，得到mRNA表达量的相对含量。MT1-MMP引物序列：上游引物5′ATC TGT GAC GGG AAC TTT GAC-3′下游引物5′ACC TTC AGC TTC TGG TTG TTG-3′，产物长度为526bp。

1.2.3 心肌中MT1-MMP蛋白免疫组化检测 MT1-MMP免疫组化一抗（编号BA1278）、即用型SABC过氧化物酶试剂盒（含二抗）（编号SA1020）均购自武汉博士德生物工程有限公司。操作步骤按说明书进行，最后使用蓝色DAB显色，核固红复染，阳性结果显示蓝黑色。图像分析使用美国IPP5.0（Image Pro-plus 5.0）专业图像分析软件测定平均吸光度值，代表MT1-MMP蛋白表达的相对含量。

1.3 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件，计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），方差齐性者两两比较采用LSD-t法，方差不齐者进行Dunnet's T3检验。相关分析采用Pearson相关分析法并建立直线回归方程。

2 结果

2.1 小鼠不同时点心肌病理变化及炎症积分比较见图1、表1。

图1 心肌细胞HE染色（C：对照组小鼠心肌未见炎症细胞浸润；V：心肌炎组15d见心肌细胞见大量炎症细胞浸润；T：治疗组15d见少量炎症细胞浸润；HE染色，×200）

由图1可见，心肌炎组和治疗组感染CVB3后的第8天，心室内可见大面积心肌细胞坏死崩解，周围出现大量炎症细胞浸润，坏死灶内可见蓝色钙化颗粒，部分心肌细胞胞质染色嗜酸性增强、均质化，胞核和细胞轮廓消失。第15、21天，心肌炎症细胞浸润面积逐渐减小。空白对照组心肌细胞正常。小鼠感染病毒后第8天开始出现死亡，至第21天心肌炎组死亡9只（30.0%），治疗组死亡5只（16.7%），空白对照组无死亡。

表1 小鼠不同时点炎症积分比较

由表1可见,治疗组炎症积分在第15天及第21天低于心肌炎组（P＜0.05或0.01）。

2.2 各组小鼠不同时点MT1-MMP mRNA比较 见图2、表2。

图2 心肌MTl-MMP mRNA的RT-PCR产物电泳结果（C：对照组；T8：T组第8天；T15：T组第15天；T21：T组第21天；V8：V组第8天；V15：V组第8天；V21：V组第21天）

表2 各组小鼠不同时点MT1-MMP mRNA光密度值比较

由图2、表2可见，心肌炎组和治疗组各时点心肌细胞MT1-MMP的mRNA含量均高于空白对照组（均P＜0.01)，治疗组在第15天及21天均低于心肌炎组（P＜0.05或0.01）。心肌炎组和治疗组心肌细胞MT1-MMP的mRNA含量在第15天达到高峰，第21天有所下降，但仍高于第8天（均P＜0.01）。

2.3 心肌中MT1-MMP蛋白免疫组化结果 见图3、表3。

图3 心肌MTl-MMP免疫组化结果（C：对照组小鼠心肌MT1-MMP染色弱阳性；V：心肌炎组15d见心肌细胞MT1-MMP染色强阳性；T：治疗组15d心肌细胞MT1-MMP染色强阳性；免疫组化染色，×200）。

表3 MT1-MMP免疫组化平均吸光度值比较

由图3、表3可见，心肌炎组和治疗组各时间点MT1-MMP免疫组化染色均成强阳性表达，治疗组在第15天及21天MT1-MMP吸光度低于心肌炎组，差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01），空白对照组心肌MT1-MMP免疫组化染色呈弱阳性。

2.4 MT1-MMP的mRNA与蛋白表达的相关性分析 MT1-MMP的mRNA与蛋白表达呈明显正相关（r＝0.823，P＜0.01），详见图4。

3 讨论

根据MMPs的结构特点可分为两种类型：分泌型MMPs及膜结合型MMPs。现在已知的MMPs大多属于分泌型MMPs，而膜结合型MMPs可以不受内源性金属蛋白酶组织抑制因子（TIMPs）的影响。MT1-MMP即MMP14是1994年由Sato等[3]首先从人胚胎cDNA文库中筛选出的一条新基因，约3.5kb，编码含582个氨基酸的蛋白质，分子量约66kDa。既往的研究表明，MT1-MMP具有降解细胞外基质、水解活性小分子物质如细胞因子、激活其他MMPs如MMP-2等作用。最近的研究发现，MTl-MMP在心肌梗死小鼠心肌中可激活纤维化信号，参与了心肌重塑[1，4]。Kim等[5]的研究也发现，机械刺激血管内皮细胞及成纤维细胞后MTl-MMP的表达明显增加。Zile等[6]通过结扎小鼠主动脉增加左心室压力负荷，发现，MT1-MMP的表达及活性在第1周明显增加，第2周下降，至第4周又明显增加，且与胶原容积片段呈明显正相关，表明MT1-MMP参与了压力负荷诱导的基质重塑及纤维化。

图4 MT1-MMP的mRNA与蛋白表达的相关性分析

在病毒性心肌炎的研究中发现，MMP-2通过裂解趋化因子MCP-3在病毒性心肌炎中发挥抗炎作用，在病毒性心肌炎小鼠敲除MMP-2基因后，心肌细胞的凋亡、重塑，病毒侵袭及心功能均较对照组恶化。此外在心力衰竭的研究中也发现，MMP-9在慢性心力衰竭患者进行心脏再同步化治疗后明显下降，可作为治疗效果评价的标志物[7]。MT1-MMP在病毒性心肌炎中的表达如何，目前报道较少。我们的研究表明，病毒性心肌炎中MT1-MMP的mRNA及蛋白表达与对照组相比均明显升高，且各时间点MT1-MMP的mRNA与蛋白表达呈明显的正相关，因此推测，MT1-MMP可能参与了病毒性心肌炎的发病。病毒性心肌炎所致的心肌局部缺血及心功能不全所致心脏容量负荷增加均可能诱导了MT1-MMP含量的增加。MT1-MMP含量的增加不仅通过激活MMP-2等基质金属蛋白酶破坏心肌间质，而且可能通过促进转化生长因子TGF-β的释放及胶原纤维的合成参与了病毒性心肌炎的病理生理过程，从而参与了慢性病毒性心肌炎所导致的扩张性心肌病及心室重构。有关MT1-MMP在病毒性心肌炎中的具体作用机制还有待实验进一步验证。

中药三七总皂甙具有抗炎，增强机体免疫力等作用。研究表明三七总皂苷可以抑制肝纤维化大鼠MMP-13、TIMP-1表达，从而对大鼠肝纤维化具有一定的保护作用[8]。另外在大鼠心肌梗死后心室重构的研究中也发现，三七总皂甙能够抑制TNF-α与MMP-2的分泌与释放，从而减轻大鼠的心肌缺血再灌注损伤[9]。我们的研究表明，三七总皂甙在病毒接种后的第15天及第21天可以降低病毒性心肌炎小鼠MTl-MMP的表达，而在第8天降低不明显，推测三七总皂甙可能通过抑制MT1-MMP的表达，在减轻心肌炎症及纤维化中可能发挥一定的作用。

[1] Dixon J A,Gaillard W F,Rivers W T,et al.Heterogeneity in MT1-MMP activity with ischemia-reperfusion and previous myocardial infarction:relation to regional myocardial function[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2010,299(6):H1947-1958.

[2] Rezkalla S,Kloner R A,Khatib G,et al.Effect of metoprolol in acute Coxsackievirus B3 myocarditis[J].J Am Coll Cardiol,1988, 12(8):412-414.

[3] Sato H,Takino T,Okada Y,et al.Amatrix metalloproteinase expressed on the surface of invasive tumour cells[J].Nature,1994, 370(6484):61-65.

[4] Spinale F G,Escobar G P,Mukherjee R,et al.Cardiac-restricted overexpression of membrane type-1 matrix metalloproteinase in mice:effects on myocardialremodeling with aging[J].Circ Heart Fail,2009,2(4):351-360.

[5] Kim J I,Cordova AC,Hirayama Y,et al.Differentialeffects ofshear stress and cyclic strain on Sp1 phosphorylation by protein kinase Czeta modulates membrane type 1-matrix metalloproteinase in endothelialcells[J].Endothelium,2008,15(1):33-42.

[6] Zile M R,Baicu C F,Stroud R E,et al.Pressure overloaddependent membrane type 1-matrix metalloproteinase induction: relationship to LV remodeling and fibrosis[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2012,302(7):H1429-1437.

[7] 王亚利,唐礼江,刘元伟,等.血清NT-pro-BNP和MMP-9水平变化评价慢性心力衰竭患者心脏再同步化治疗疗效的可行性研究[J].浙江医学,2014,36(10):850-853.

[8] 姜辉,夏伦祝,李颖,等.三七总皂苷对肝纤维化大鼠基质金属蛋白酶-13及其抑制因子-1表达的影响[J].中国中药杂志,2013,38(8): 1206-1210.

[9] 郭洁文,邓志军,符永恒,等.三七总皂苷对心梗后心室重构大鼠肿瘤坏死因子-α与基质金属蛋白酶表达的影响及其作用机制[J].南方医科大学学报,2009,29(10):2048-2050.

Expressions of MT1-MMP in myocardium of mice with viral myocarditis

RONG Xing,WU Tingting,XIA Tianhe,et al.Children Heart Center of Yuying Pediatrics Hospital,Wenzhou Medical University,Wenzhou 325027,China

Objective To investigate the expression of membrane type 1 matrix metalloproteinase(MT1-MMP)in myocardium of mice with viral myocarditis,and the effect of panax notoginsenosides(PNS)on MT1-MMP. Methods Sixty eight inbred male Balb/C mice of 4～6 weeks were divided randomly into 3 groups:the mice in blank group(group C)were inoculated intraperitoneally(i.p.)with free virus 1640 culture solution 0.1ml on day 0,the mice in VMC group (group V)were inoculated i.p. with 0.1ml Tissue Culture Infectious Dose 50 (TCID50)of 10-4.36/ml Coxsackie viruses B3 (CVB3)on day 0,the mice in treatment group(group T)were inoculated i.p with Coxsackie viruses B3 and PNS 180mg/kg.The animals were sacrificed on d8,d15,and d21 after infections.The hearts tissue slides were HE stained for histological changes;and immunohistochemically (IHC)stained for MT1-MMP protein expression.The MT1-MMP mRNA expression was detected by RT-PCR method. Results The expressions of MT1-MMP mRNA in groups V and T were higher than group C in all time points(P＜0.01);the expression was lower in group T than that in group Vat d15 and d21(P＜0.05 or 0.01).The IHC staining showed that myocardial cells had strong expression of MT1-MMP in groups V and T and mild expression in the group C.Compared with group V,the IHC OD values of group T was significantly lower at d15 and d21(P＜0.05 or 0.01). Conclusion MT1-MMP may be involved in the pathogenesis of viral myocarditis in mice.Traditional Chinese medicine PNS may have some therapeutic effect by reducing the expression of MT1-MMP.

Viral myocarditis Membrane type 1 matrix metalloproteinase Panax notoginsenosides Mice

2015-05-01）

（本文编辑：马雯娜）

浙江省自然基金（Y2100670）

325027 温州医科大学附属第二医院、育英儿童医院儿童心脏中心

吴蓉洲，E-mail:wrz71@hotmail.com