Synphilin-1转基因小鼠纹状体多巴胺代谢变化的研究

金洪国 周敏 何松彬 唐维国

Synphilin-1转基因小鼠纹状体多巴胺代谢变化的研究

金洪国 周敏 何松彬 唐维国

目的 探讨Synphilin-1蛋白对小鼠黑质纹状体多巴胺能神经元递质传递的影响。方法 利用转基因技术制备Synphilin-1转基因小鼠（转基因组，11只），另以野生型小鼠为非转基因组（11只）作对照。通过加速转圈测试和足迹分析观察两组小鼠的运动能力。分别测定两组小鼠的多巴胺及其代谢产物，并且测定参与纹状体多巴胺代谢酶的表达水平，进行分析比较。结果 转基因组小鼠的运动能力较非转基因组下降（转圈能力减弱、步长较短），且转基因组小鼠表现为短暂步态。Synphilin-1蛋白使黑质纹状体多巴胺能神经元的多巴胺代谢产物/多巴胺的比例明显下降（P＜0.05），而参与多巴胺代谢的酶的含量并无明显变化（P＞0.05）。结论 Synphilin-1蛋白引起小鼠运动能力损害，对黑质纹状体多巴胺代谢影响主要是通过改变突触前膜多巴胺能神经元递质传递来实现的。

Synphilin-1 帕金森病 转基因小鼠 多巴胺 3，4-二羟基苯乙酸

帕金森病是一种缓慢进展的神经系统退行性疾病，主要病理特征是中脑黑质致密部多巴胺能神经元变性、丢失及残存神经元中路易小体的形成[1-2]。帕金森病的病因和发病机制尚不清楚，可能是遗传因素和环境因素共同作用的结果。家族性帕金森病与遗传因素有关，但大多数患者的病因尚不明了。Synphilin-1是α-Synuclein的相互作用蛋白，在路易小体内含量丰富，能促进路易小体样包涵体的形成，并参与突触传递的许多环节[3]，但目前医学界对该蛋白的功能仍知之甚少。笔者为了进一步了解Synphilin-1对黑质纹状体多巴胺能神经递质传递的影响，在Synphilin-1转基因小鼠进行了研究，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 转基因小鼠的制备 鼠朊蛋白启动子载体Mo-PrP.XhoI由美国模式培养物保藏所提供。亚克隆有人类Synphilin-1的cDNA编码区的pcDNA3载体，购自美国BD Biosciences公司（批号VT2051），在结构内用HA序列作标记[4]。然后将用HA作标签的全长Synphilin-1 cDNA亚克隆到MoPrP.XhoI载体的XhoI位点上。NotI位切除MoPrPHA-Synphilin-1质粒注入到C57BL/6小鼠受精卵，构造转基因小鼠[5]。首建小鼠与野生型C57BL/6小鼠交配产生纯合子转基因小鼠[5]。通过PCR检测后代小鼠尾巴活组织内的DNA，确定基因型并筛选出转基因小鼠。采用11只转基因小鼠作为转基因组，40～41（40±4）周龄;体重29～37（33±4）g;11只野生型小鼠作为对照组，40～41（40±3）周龄;体重25～37（31±6）g。本实验在东方生物服务中心及广岛大学神经内科研究所进行。

1.2 小鼠基因型确定 每只小鼠剪断1cm尾巴，从尾巴的活组织中提取DNA进行PCR检测。HA标记的5′端区域Synphilin-1 DNA通过PCR扩增，使用以下的正向和反向引物：5′-TGTACCCATACGATGTTCC-3′和5′-GTACACATCAGCGATTCCT-3′。

1.3 转基因小鼠运动能力分析 转圈试验采用日本成茂SR-5R型转圈试验系统，按照文献[6]所述进行。小鼠分别置于转圈速度为32r/min及从4r/min加速至40r/min的旋转转子上。每只小鼠连续接受两种速度的转圈试验，记录每只小鼠转圈最长时间用于结果分析。依据文献[7]所述进行步态分析。小鼠前爪蘸蓝色无毒涂料后放置在步行轨道的一端，当小鼠顺利步行到轨道的另一端，留下蓝色足迹后更换新的白色纸依次进行实验。连续6个足迹测定和连续串行6个足印的步长用于结果分析。

1.4 高效液相色谱法测定多巴胺及其代谢产物、多巴胺代谢比水平 采用日本岛津公司LC-20A型高效液相色谱仪测定两组黑质纹状体内多巴胺、3，4-二羟基苯乙酸（3，4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC）、高香草酸、3-甲氧酪胺（3-methoxytyra mine，3-MT）含量。然后测定高香草酸+DOPAC/多巴胺、DOPAC/多巴胺、高香草酸/多巴胺、3-MT/多巴胺等多巴胺代谢比水平。色谱柱：ODS柱（日本Eicom公司，AC-ODS型）；流动相：0.1mol/L柠檬酸、0.1mol/L乙酸钠（87%）、甲醇（13%）、辛烷磺酸钠（160mg/L），pH 3.9；流速：1.0ml/ min；柱温：25°C；进样量：20μl。用氟烷吸入麻醉小鼠后，迅速取出大脑放置于5倍体积的冰冷裂解缓冲液中（0.5%Triton X-100，50mM Tris-HCl，pH 7.4，140 mM KCl和3mM EDTA），并加入蛋白酶抑制剂，匀浆1min后，15 000×g条件下离心20min，取上清液，过纤维膜过滤，将过滤得到的均浆在上述条件下再离心15min，再过滤后进行分析[4]。

1.5 蛋白免疫印迹法测定多巴胺代谢相关蛋白的表达 用CO2处死小鼠并将其脑组织冷藏（－80°C）。提取脑组织蛋白（50μg）加混有蛋白酶抑制剂（德国Roche Applied Science公司，批号4693116001）的TES缓冲液（50mM Tris，pH 7.5；2mM EDTA；100mM NaCl）经4°C变性 30min，在2000×g条件下离心20min，提取上清液，上样于10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳1.5h；通过转移系统将分离的蛋白转移至硝化纤维膜上（Whatman型），约60min。5%脱脂奶粉溶液于室温封闭1h，用TBST（10mM Tris，pH 7.5；0.15M NaCl；0.1%Tween 20）漂洗10min×3次；加入β-肌动蛋白抗体（1∶10 000，Sigma公司A4700型）室温孵育1h，TBST漂洗10min×3次；加ECL发光显色剂，暗室内压片，用洗脱缓冲液洗消化纤维膜30min，测定与多巴胺代谢相关蛋白：单胺氧化酶A（MAO-A），单胺氧化酶B（MAO-B），儿茶酚氧位甲基转移酶（catechol-O-methyltransferase,COMT）表达水平。α-微管蛋白（αtubulin）作为内参，与目的蛋白对比，得到目的蛋白/内参比值。

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料用表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 Synphilin-1转基因小鼠运动能力分析 在恒定的低速转圈试验，两组小鼠比较运动能力差异无统计学意义（数据未示出）。然而，在32r/min高速旋转和从4r/min至40r/min的加速转圈测试条件下，转基因组转圈能力（[108±15）、（7±3）s]较非转基因组（[156±38）、（27±15）s]减弱，两组比较差异均有统计学意义（t= 3.89、4.33，均P＜0.05，图1A）。两组连续6个足迹测定结果显示，转基因组较非转基因组表现短暂步态（图1 B）。两组连续串行6个足印的步长统计分析显示，转基因组步长 （[3.8±0.3）cm]明显短于非转基因组 （[4.5± 0.2）cm]，差异有统计学意义（t=6.48，P＜0.05，图1C）。

2.2 Synphilin-1对黑质纹状体中多巴胺及其代谢产物含量的影响 见表1。

表1 Synphilin-1对黑质纹状体中多巴胺及其代谢产物含量的影响（ng）

由表1可见，转基因组黑质纹状体中多巴胺及其代谢产物含量低于非转基因组，但两组差异无统计学意义（均P＞0.05）。

2.3 Synphilin-1对黑质纹状体中多巴胺代谢比水平的影响 见表2。

由表2可见，转基因组的黑质纹状体中多巴胺代谢比水平均低于非转基因组，两者比较差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）。

2.4 两组的多巴胺代谢相关蛋白免疫电泳及蛋白表达水平比较 见图2。

表2 Synphilin-1对黑质纹状体中多巴胺代谢比水平的影响

图1 Synphilin-1转基因小鼠运动能力分析（A：两组转圈能力比较；B：两组的足迹测定比较，转基因组较非转基因组表现短暂步态；C：两组的步长比较；N：非转基因组；Tg：转基因组）

图2 两组的多巴胺代谢相关蛋白免疫电泳及蛋白表达水平比较（Tg-：非转基因组；Tg+：转基因组）

由图2可见，两组黑质纹状体内参与多巴胺代谢酶的水平比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

3 讨论

目前已经明确证实有4个基因突变后导致帕金森病，包括α-Synuclein、Parkin、泛素羧基端水解酶-L1和DJ-1[8-12]。在这4个突变基因中，有关α-Synuclein的研究较多。研究发现，α-Synuclein在多巴胺能神经传递中起负性调节的作用[13-15]。Synphilin－1蛋白是与α-Synuclein相互作用的蛋白[3，16]。Synphilin-1基因突变是否是引起α-Synuclein聚集，Synphilin-1蛋白 与α-Synuclein之间的关系如何目前尚不清楚。据此本研究制备了Synphilin-1转基因小鼠模型，并通过步态分析评价转基因小鼠的运动能力。结果发现，转基因小鼠的运动能力减弱，导致这一结果的关键因素可能是Synphilin-1参与多巴胺的传递及分解代谢过程。多巴胺能神经元递质传递及摄取抑制主要表现为多巴胺及其代谢产物的比例变化。本次研究结果显示：转基因组与非转基因组比较，3-MT/多巴胺、DOPAC/多巴胺、高香草酸/多巴胺代谢比明显减低。

黑质纹状体内的多巴胺为汇集于神经末梢的多巴胺（占大部分）和被释放出的多巴胺的总和。高香草酸为被释放出的多巴胺和神经细胞内多巴胺的代谢产物。3-MT为被释放出细胞外多巴胺的代谢产物，是一个重要的多巴胺释放指数；相反，DOPAC是多巴胺在细胞内代谢时产生。有研究结果显示，Synphilin-1基因表达于突触前膜，可以通过抑制钾离子浓度的升高而促进多巴胺的释放，使细胞内游离的多巴胺减少，而细胞间隙多巴胺含量增加，这一结果或许可以解释DOPAC/多巴胺比例下降的原因[17]。但是，长期的去极化又可导致多巴胺能神经元受抑制，进而影响其递质传递及运输过程；3-MT/多巴胺比例下降说明细胞外多巴胺的代谢减低，即突触后膜多巴胺的摄取减少所致，进而使细胞间隙多巴胺含量增加。目前还不清楚Synphilin-1蛋白对多巴胺的摄取及传递的具体作用机制，但本研究结果已经可以初步证实Synphilin-1蛋白具有促进多巴胺在突触囊泡的运输传递而抑制神经末梢的再摄取过程。

4 志谢

感谢日本广岛大学神经内科松本教授对本课题给予的帮助与指导。

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Metabolic changes of dopaminergic neurons in synphilin-1 transgenic mice

JIN Hongguo，ZHOU Min，HE Songbin，et al.Department of Neurology，Zhoushan Hospital，Zhoushan 316021,China

Objective To investigate the effect of synphilin-1 on the metabolism of dopamine in dopaminergic neurons. Methods Rotarod performance test and step length test were conducted in 11 synphilin-1-transgenicmiceand 11 non-transgenic mice(controls).The levels of dopamine,dopamine metabolites and related enzymes were measured. Results The motor function was exhibited in synphilin-1-transgenic mice (P＜0.05).The enzyme activities related to dopamine metabolism in transgenic mice were not changed compared to control group(P＞0.05). Conclusion Synphilin-1 is involved in motor functional impairments,which may be associated with the release and repackage of dopamine at the presynaptic membrane of dopaminergic neuron.

Synphilin-1 Parkinson's disease Transgenic mice Dopamine 3,4-Dihydroxyphenylacetic acid

2014-07-24）

（本文编辑：杨丽）

浙江省科技厅钱江人才计划项目（2010R10078）

316021舟山医院神经内科

金洪国，E-mail：jhgyj2003@163.com