针刺水沟、风府穴对脑缺血模型大鼠血一氧化氮及内皮素含量的影响

黄乃好，吴生兵，杨 帆，李 曌，史晓丽，汪 洋

(1.北京市丰台中西医结合医院康复医学科，北京 100072；2.安徽中医药大学新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230038)



针刺水沟、风府穴对脑缺血模型大鼠血一氧化氮及内皮素含量的影响

黄乃好1，吴生兵2，杨 帆1，李 曌1，史晓丽1，汪 洋1

(1.北京市丰台中西医结合医院康复医学科，北京 100072；2.安徽中医药大学新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230038)

目的 探讨针刺水沟-风府穴组治疗缺血性脑卒中的作用机制。方法 将40只大鼠分为正常组、模型组、水沟-风府组(针刺大鼠水沟、风府穴)、非经非穴组(针刺大鼠臀部两处非经非穴点)，每组10只。采用阻闭大鼠大脑中动脉制备永久性脑缺血模型。72 h后观察各组大鼠神经功能评分，血清一氧化氮及血浆内皮素含量的变化。结果 与模型组比较，水沟-风府组脑缺血大鼠神经功能评分明显降低(P<0.05)，而非经非穴组无明显变化(P>0.05)。与模型组比较，非经非穴组大鼠血清一氧化氮及血浆内皮素含量无明显变化(P>0.05)，水沟-风府组大鼠血清一氧化氮及血浆内皮素含量明显降低(P<0.05)。结论 针刺水沟-风府穴组对缺血性脑卒中具有明显的改善作用，其机制可能与降低血液中一氧化氮、内皮素的含量有关。

针刺；水沟；风府；脑缺血；一氧化氮；内皮素

目前，脑卒中已成为世界各国致残和致死的主要疾病之一[1]。中国每年有150万 ～200万新发脑卒中的病例，目前缺血性脑卒中占现存脑血管病患者的70%以上[2]。因此，寻求预防治疗该病的有效方法成为当今热门的课题，其中针灸在预防治疗该病方面起到非常重要的作用。本研究通过电针水沟和风府两穴对脑缺血模型大鼠血一氧化氮(nitric oxide，NO)及内皮素(endothelin，ET)含量的影响，并初步探讨针刺防治脑缺血的作用机制，并验证以上两穴在临床治疗中的作用。

1 材料

1.1 实验动物与分组 选用健康清洁级SD大鼠40只，雌雄各半，8周龄，体质量为(180±20)g，由安徽医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(皖)2011-002。将40只大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、水沟-风府组及非经非穴组。每组10只。

1.2 主要试剂及仪器 722型分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；原子吸收分光光度计：美国热电；智能型γ计数仪：上海原子核研究所；TGL-16型高速离心机：江苏荣华；PCE-A 型程控电针治疗仪：安徽天恒；NO测定试剂盒：南京建成生物工程研究所提供；ET放免试剂盒：解放军总医院科技开发中心放免研究所提供。

2 方法

2.1 模型复制方法 采用阻闭大鼠大脑中动脉制备永久性脑缺血模型[3]。术前禁食12 h，自由饮水。用10%水合氯醛腹腔注射(3.5 mL/kg)麻醉，术中动物保持自主呼吸，将大鼠放置在恒温加热板上，保持大鼠体温恒定为37.0 ℃左右。颈部常规无菌操作，从颈部正中纵向切口，暴露颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈总动脉及颈外动脉，在颈总动脉分叉部的下方剪一小切口，将尼龙单纤丝线一末端插入颈内动脉17～18 mm，扎紧动脉残端，完全阻断大脑中动脉的血流，缝合皮肤。

2.2 神经功能评分标准 按照改进的Zea Longa评分法[4]，分别于术后24、48、72 h进行神经行为学评定。评分标准：无明显神经行为学症状，0分；不能完全伸展左侧前爪，1分；向左侧旋转，2分；行走时向左侧倾倒，3分；只在刺激时行走，4分。将0分、不能自行行走及昏迷不醒者剔除。3次神经行为学评分分别取平均数进行统计。

2.3 治疗方法 参照《实验针灸学》[5]对水沟、风府进行定位。水沟，唇裂鼻尖下1 mm正中处；风府，枕骨顶嵴后枕寰关节背凹陷处。非经非穴：选取大鼠臀部非经非穴点两处(臀大肌外上象限内，按文献[5]无经络和穴位处)。除正常组和模型组外，其余两组于模型复制成功24 h后分别针刺，连续3 d。大鼠清醒后将其放入固定器中，无菌操作所取穴位，13 mm长毫针刺入3～5 mm，接通电针仪。用2～100 Hz混频疏密波，强度为1～3 mA，以四肢颤抖为度，每次20 min，每日1次，共3次。

2.4 观察指标及检测方法 末次电针治疗结束后，禁食12 h，自由饮水，进行末次神经行为学评定，腹主动脉采血3～5 mL，置于10 mL试管中，立即抽取1.5 mL，注入带有抗凝剂塑料子弹头管，混匀，3 000 r/min低温离心，取血清，低温(<20 ℃)保存，待测NO。立即抽取等量血液以3 000 r/min低温离心，取血浆，低温(<20 ℃)保存，待测ET。采用硝酸还原酶法测定血清NO含量，放射免疫法测定血浆ET含量。

3 结果

3.1 各组大鼠神经功能评分比较 与模型组比较，水沟-风府组脑缺血大鼠神经功能评分明显降低(P<0.05)，而非经非穴组无明显变化(P>0.05)。说明针刺水沟-风府穴组可明显降低脑缺血大鼠神经功能评分，改善脑缺血大鼠神经功能。见表1。

表1 各组大鼠神经功能评分比较±s)

注：与模型组比较，#P<0.05；与非经非穴组比较，△P<0.05。

3.2 各组大鼠血清NO及血浆ET含量比较 与正常组比较，模型组大鼠血清NO及血浆ET含量明显升高(P<0.05)，表明模型复制成功；与模型组比较，非经非穴组大鼠血清NO及血浆ET含量无明显变化(P>0.05)，水沟-风府组大鼠血清NO及血浆ET含量明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清NO及血浆ET含量比较±s)

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与非经非穴组比较，△P<0.05。

4 讨论

缺血性脑卒中又名“中风”，因本病起病急骤，证见多端，变化迅速，与风性善行数变的特性相似，故以“中风”命名之。其病理因素可归纳为火、风、痰、气、瘀，以肝肾阴虚为本，同时受自然环境、气候变化、五运六气、饮食劳倦、情绪因素、性别、年龄等影响。因其对人类的健康危害极大，寻求治疗该病方法已成为临床和基础医学的重要课题。目前临床上治疗该病药物疗法仍是有效手段之一，但是药物在干预相应靶器官、靶细胞的同时，往往给患者造成不可避免的毒性及不良反应。而应用针刺治疗缺血性脑损伤疗效肯定[6]，不仅广泛运用于恢复期治疗，而且已被越来越普遍地应用于急性期的辅助治疗，其疗效也被广泛肯定[7-8]。督脉起于下极之输，并于脊里，上至风府，入脑，上巅，临床督脉穴位常用于治疗脑病，水沟、风府同为督脉的穴位。有些学者采用针刺水沟或风府为主治疗脑缺血疾病，取得较好的临床疗效[9-11]。本课题组前期研究也证实针刺水沟-风府穴组能干预脑出血模型大鼠脑组织形态学、血清心肌酶等指标而发挥作用[12]。

缺血性脑卒中病理机制非常复杂，包括能量代谢障碍与梗死灶周围缺氧去极化和兴奋性氨基酸毒性、氧化应激损伤、炎性反应、神经细胞凋亡等，它们均由缺血引发，发生在不同时间点，彼此重叠并相互联系。而NO和ET是体内重要的血管活性因子，并参与了脑缺血损伤的病理生理过程，本研究观察在脑缺血过程中血清NO及血浆ET含量的变化及针刺的影响。

NO是在一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)的催化下，由L-精氨酸氧化产生的一种气体活性因子，在脑缺血过程中具有复杂的作用机制[13]，脑缺血早期结构型一氧化氮合酶(constitutive nitric oxide synthase，cNOS)活化并产生的NO舒张血管，维持脑血流、抗血小板聚集和黏附，对脑缺血具有保护作用；但随缺血时间的延长，缺血区域炎性细胞浸润使诱导型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase，iNOS)活性及表达升高，产生大量的NO，具有细胞毒性作用。NO发挥着保护和损伤的双重作用，在脑缺血损伤中可能与释放的时间、量及来源有密切的关系。ET是由内皮细胞释放的，由氨基酸残基组成的活性多肽，分布于血管内皮细胞及中枢神经系统。在脑缺血损伤中，在来源、体循环中，还是脑缺血区的ET，均具有收缩脑血管、调节脑血流的作用[14]。同时ET在脑缺血损伤过程中促进自由基的产生，加大脑损伤程度。此外，在预实验中，检测NO在血清中含量变化明显，ET在血浆中含量变化明显，更有利于本研究实施，故选取血清中NO及血浆中ET作为观察指标。

本研究结果显示，与模型组比较，针刺水沟-风府穴组能够降低大鼠的血清NO及血浆ET含量，脑缺血大鼠神经功能评分明显降低，而非经非穴组均无明显变化。说明在脑缺血损伤机制中，过多产生的NO可与超氧自由基反应，引起细胞损伤，同时介入谷氨酸能神经细胞的毒性作用，介导细胞死亡。因此，针刺水沟-风府穴组能够有效地抑制NO、ET的过度升高，最大程度地保护脑缺血后神经功能损伤，这可能是针刺治疗脑缺血损伤的机制之一。

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Effect of Acupuncture at Shuigou and Fengfu Points on Levels of Nitric Oxide and Endothelin in Rats with Cerebral Ischemia

HUANG Nai-hao1, WU Sheng-bing2, YANG Fan1, LI Zhao1, SHI Xiao-li1, WANG Yang1

(1. Department of Rehabilitation Medicine, Integrated Traditional Chinese and Western Medical Hospital of Fengtai District, Beijing 100072, China; 2. Key Laboratory of Xin’an Medicine, Ministry of Education, Anhui University of Chinese Medicine, Anhui Hefei 230038, China)

Objective To investigate the mechanism of action of acupuncture at Shuigou-Fengfu points in the treatment of ischemic stroke. Methods A total of 40 rats were divided into normal group, model group, Shuigou-Fengfu group (acupuncture at Shuigou-Fengfu points), and non-acupoint group (acupuncture at two non-acupoints in the hip), with 10 rats in each group. A rat model of permanent cerebral ischemia was established by occlusion of the middle cerebral artery. The neurological score and changes in serum levels of nitric oxide (NO) and endothelin (ET) were observed at 72 hours after treatment. Results Compared with the model group, the Shuigou-Fengfu group had a significant reduction in the neurological score of rats with cerebral ischemia (P<0.05); there was no difference in such score between the model group and the non-acupoint group (P>0.05). Compared with the model group, the non-acupoint group had no significant changes in the levels of serum NO and plasma ET (P>0.05), while the Shuigou-Fengfu group had significant reductions in the levels of serum NO and plasma ET (P<0.05). Conclusion Acupuncture at Shuigou-Fengfu points can significantly improve ischemic stroke, and its mechanism may be related to the reduction in the levels of NO and ET in blood.

Acupuncture; Shuigou; Fengfu; Cerebral ischemia; Nitric oxide; Endothelin

安徽高校省级自然科学研究项目(KJ2016A857)；高校优秀中青年骨干人才国内外访学研修重点项目(gxfxZD2016115)

黄乃好(1976-)，男，硕士，副主任医师

吴生兵，wsb922@126.com

R255.2；R743.3

10.3969/j.issn.2095-7246.2016.06.019

2016-10-26；编辑：曹健)