α1抗胰蛋白酶治疗皮肤光老化的作用及对抗氧化物水平的影响

秦 铮 张桂云 刘腾飞 杨文娟 姚春丽

(吉林大学第二医院皮肤科，吉林 长春 130041)



α1抗胰蛋白酶治疗皮肤光老化的作用及对抗氧化物水平的影响

秦 铮 张桂云 刘腾飞 杨文娟 姚春丽

(吉林大学第二医院皮肤科，吉林 长春 130041)

目的 探讨α1抗胰蛋白酶(AAT)对豚鼠皮肤光老化的治疗作用并检测皮肤组织中抗氧化物的变化。方法 60只健康雌性豚鼠随机分为空白组(SC)、预防治疗组(Pre)和模型组(MC)，建立光老化模型，Pre组造模同时给予AAT预防治疗。酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒检测皮肤组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、羟脯氨酸(Hyp)、丙二醛(MDA)的含量。结果 与SC组相比，MC组皮肤组织中MDA 含量明显增多，GSH-Px、SOD 活力及Hyp含量降低(P<0.05)；与MC组相比，AAT治疗后MDA 减少，GSH-Px、SOD活力及Hyp含量增加(P<0.05)。结论 AAT可延缓和治疗豚鼠皮肤光老化，其作用机制可能与提高老化皮肤组织中抗氧化物含量并抑制氧化还原反应有关。

皮肤光老化；α1抗胰蛋白酶(AAT)；抗氧化物

皮肤光老化是指暴露部位皮肤由环境因素如紫外线辐射、风吹、日晒及接触有害化学物质等引起的急、慢性损伤，而紫外线是最重要的影响因素〔1〕。皮肤光老化的临床表现包括暴露部位皮肤皱纹、色素沉着、皮肤粗糙、干燥脱屑、肤色灰黄、毛细血管扩张、皮革样外观等，严重的可引起癌前病变，甚至皮肤恶性肿瘤〔2～4〕。大量研究证实α1抗胰蛋白酶(AAT)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有抗感染、调节免疫、抑制细胞凋亡、维系人体生理循环等作用，但在皮肤光老化中的应用报道极少。本实验旨在探讨AAT对皮肤光老化的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 白色健康雌性豚鼠60只，体重(220±20)g，长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供。

1.1.2 试剂 甲氧沙林溶液(邦力)：重庆华邦制药有限公司；AAT：佛罗里达大学药学院提供；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、羟脯氨酸(Hyp)、丙二醛(MDA)试剂盒：购于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 建立豚鼠皮肤光老化模型及分组 60只豚鼠随机分为空白组(SC)和模型组(MC)，应用甲氧沙林联合UVA+UVB造模。MC组中随机选取6只为预防治疗组(Pre)，造模同时给予AAT 20 mg/只预防治疗。造模成功后随机分为阳性组(Pos)、外用高(EH)、低剂量组(EL)、腹腔注射高(IH)、低剂量组(IL)、阴性对照组a(VC-a，腹腔注射盐水)、阴性对照组b(VC-b，外用凝胶)，进行相应干预治疗。治疗2 w后观察各组豚鼠皮肤外观变化。

1.2.2 检测组织中抗氧化酶活性和MDA含量 治疗结束，将动物处死，取照射区新鲜皮肤组织制成10%组织匀浆，离心提取上清液。采用酶联免疫吸附法(ELISA)分别测SOD、GSH-Px、Hyp、MDA含量。

1.3 统计学分析 采用SPSS22.0软件行ANOVA分析。

2 结 果

2.1 不同干预治疗后大体及病理变化 AAT治疗后，各组皱纹、皮屑、色素沉着等均有所改善。Pre、IH组皱纹明显淡化，无明显静态皱纹，无皮屑及色素沉着；HE染色皮肤略增厚。IL组皱纹也明显变浅，仅见少量细小静态周围，有极少量皮屑和轻度色素沉着；HE染色见皮肤较IH组厚，皮肤结构完整，纤维组织排列不规则，有少量炎症细胞浸润。Pos组暴露部位皮肤浅在静态皱纹，仅有少量皮屑，色素沉着不明显；HE染色见皮肤较SC组增厚，结构稍有异常，纤维组织排列部分不规则，有少量炎症细胞浸润。VC-a、VC-b组皮肤有明显静态皱纹，大量皮屑，色素沉着明显，皮肤弹性差，缺乏光泽；HE染色见皮肤明显增厚，纤维组织排列紊乱，有炎细胞浸润。见图1。

2.2 AAT对皮肤组织中抗氧化酶活力的影响 与SC组相比，MC组SOD、GSH-Px、Hyp均下降(P<0.05)。而与MC组相比，治疗组(包括AAT预防治疗、AAT腹腔注射、AAT外用、维甲酸治疗)SOD、GSH-Px、Hyp均升高(P<0.05)。相同剂量AAT治疗(包括预防治疗、腹腔注射高剂量、外用高剂量)后SOD、GSH-Px、Hyp的变化无统计学意义(P>0.05)。AAT高剂量组(包括腹腔注射和外用)组织中SOD、GSH-Px、Hyp的变化较低剂量组(包括腹腔注射和外用)明显(P<0.05)。与阳性组相比，AAT高剂量组(包括腹腔注射和外用)中SOD、GSH-Px、Hyp变化明显(P<0.05)。 见表1。

2.3 AAT对皮肤组织中MDA的影响 与SC组相比，MC组MDA升高(P<0.05)，而与MC组相比，治疗组(包括AAT预防治疗、AAT腹腔注射、AAT外用、维甲酸治疗)MDA降低(P<0.05)。相同剂量AAT治疗(包括预防治疗、腹腔注射高剂量、外用高剂量)后MDA的变化无统计学意义(P>0.05)。AAT高剂量组(包括腹腔注射和外用)MDA的变化较低剂量组(包括腹腔注射和外用)明显(P<0.05)。与阳性组相比，AAT高剂量组(包括腹腔注射和外用)中MDA变化明显(P<0.05)。见表1。

图1 不同组治疗后病理变化(HE染色)

组别SOD(U/mg)GSH-Px(U/mg)Hyp(μg/mg)MDA(nmol/mg)SC35.78±2.841)208.30±13.221)6.35±0.991)10.58±1.371)MC10.51±1.77105.21±9.963.62±0.9321.94±4.96Pre35.19±3.301)196.62±13.881)5.69±1.291)12.27±3.501)IH34.96±3.331)2)4)178.26±17.461)2)4)5.81±1.771)2)4)13.37±2.011)2)4)IL21.94±3.711)158.68±17.891)4.46±1.291)18.74±3.191)EH34.73±4.291)2)4)179.91±22.171)2)4)5.38±1.491)2)4)13.82±4.761)2)4)EL22.23±3.461)153.50±21.701)4.05±1.101)18.11±3.921)Pos29.00±4.921)170.52±20.531)4.81±1.331)16.88±2.981)VC-a10.78±2.91105.08±12.444.00±1.1620.85±1.84VC-b10.44±2.33104.75±10.603.70±0.9320.79±4.78

与MC组比较：1)P<0.05，与IL组比较：2)P<0.05；与EL组比较：3)P<0.05；与POS组比较：4)P<0.05

3 讨 论

皮肤光老化多由过度紫外线照射引起氧化应激反应导致，而人体皮肤有复杂的内源性抗氧化防御体系来对抗氧化应激反应。一般情况下，内源性抗氧化酶(SOD、GSH-Px等)能够有效地清除紫外线照射产生的自由基，以保护皮肤组织。但是，过度或长期暴露于紫外线中，组织内产生大量自由基，超过皮肤内源性抗氧化能力，造成组织代谢紊乱，结构破坏，最终皮肤表现出光老化症状，故提高抗氧化物活力是目前延缓皮肤老化的有效方法。

过量的自由基使皮肤组织中抗氧化体系破坏，导致氧化性损伤，使抗氧化酶活性下降及脂质过氧化产物堆积；大量自由基还可破坏DNA结构，使DNA链断裂、碱基氧化〔5，6〕。SOD可以有效清除机体内的自由基，防止或减轻自由基对机体的损伤，GSH-Px的活力是衡量机体抗氧化水平的重要指标。Hyp含量可推断皮肤老化程度〔7〕。本实验证实了光老化皮肤组织中抗氧化物含量减少，AAT可增加机体抗氧化反应的能力。MDA含量可反映机体脂质过氧化程度，间接反映细胞受损程度。紫外线照射通过催化脂质过氧化反应引起MDA增加，AAT治疗组后MDA含量明显减少，可推断AAT有抑制脂质过氧化反应的作用。AAT是分子量为52 kD的单链糖蛋白，能抑制多种丝氨酸内切肽酶如弹性蛋白酶、胰蛋白酶、血浆素、凝血酶等蛋白酶的活性，以保护正常细胞和器官不受蛋白酶的损伤，维持机体内环境平衡。AAT还可通过与组织中性粒细胞相互作用，抑制活性氧的产生，起到抗炎作用〔8〕。本实验证实了AAT易被吸收，给药途径不影响其吸收效果，且AAT的治疗效果在一定浓度范围内与浓度相关。

1 Zhuang Y，Hou H，Zhao X，etal.Effects of collagen and collagen hydrolysate from jellrfish(Rhopilema esculentum)on mice skin photoaging induced by UV irradiation〔J〕.J Food Sci，2009;74(6)：H183-8.

2 Yaar M，Eller MS，Gilchrest BA.Fifty years of skin aging〔J〕.J Invest Dermatol Symp Proc，2002;7(1):51-8.

3 Pandel R，Poljšak B，Godic A，etal.Skin photoaging and the role of antioxidants in its prevention〔J〕.Isrn Dermatology，2013;2013(2013):930164.

4 Berneburg M，Plettenberg H，Krutmann J.Photoaging of human skin〔J〕.Photodermatol Photoimmunol Photomed，2000;16(6):239-44.

5 Ryoo YW，Suh SI，Mun KC，etal.The effects of the melatonin on ultraviolet-B irradiated cultured dermal fibroblasts〔J〕.J Dermatol Sci，2001;27(3):162-9.

6 Gilchrest BA.Photoaging〔J〕.J Am Acad Dermatol，2013;133(1):2-6.

7 Feng Y，Xu J，Qin Z，etal.Alpha-1 antitrypsin prevents the development of preeclampsia through suppression of oxidative stress〔J〕.Front Physiol，2016;7(119).

8 Bergin DA，Hurley K，Mcelvaney NG，etal.Alpha-1 antitrypsin: a potent anti-inflammatory and potential novel therapeutic agent〔J〕.Arch Immunol Et Ther Exp，2012;60(2):81-97.

〔2016-10-20修回〕

(编辑 曲 莉)

吉林省省级经济结构战略调整引导资金专项项目(No.2015Y030-1)； 吉林省科技发展计划重点科技攻关项目(No.20140204021YY)

姚春丽(1970-)，女，主任医师，硕士生导师，主要从事皮肤外科疾病研究。

秦 铮(1990-)，女，在读硕士，主要从事皮肤外科疾病研究。

R332

A

1005-9202(2016)23-5827-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.023