凝血因子Ⅻ基因多态性与急性心肌梗死的关联性研究

刘媚娜 金艳慧 程水兵 徐琦煜 刘欢乐 王明山

凝血因子Ⅻ基因多态性与急性心肌梗死的关联性研究

刘媚娜 金艳慧 程水兵 徐琦煜 刘欢乐 王明山

目的 分析急性心肌梗死（AMI）患者凝血因子Ⅻ（FⅫ）基因多态性和急性发作时血浆凝血因子Ⅻ活性（FⅫ:C）的变化及意义。方法 收集97例AMI患者治疗前及76例对照血液标本，采用直接测序法检测FⅫ第46位基因多态性和一期凝固法检测血浆FⅫ:C，并进行比较分析。结果 FⅫ基因C46T多态位点CC、CT、TT 3种基因型以及C、T等位基因频率在AMI组与对照组中的分布均无统计学差异（均P＞0.05）。CC、CT和TT 3种基因型分别对应的血浆FⅫ:C水平有统计学差异（P＜0.01），以CC组活性最高，TT组活性最低。AMI组血浆FⅫ:C显著低于对照组（P＜0.01）。结论 FⅫC46T基因多态性与AMI无关联，AMI发病时血浆FⅫ:C显著降低，FⅫ参与血栓形成。

心肌梗死 凝血因子Ⅻ 基因多态性

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）属于冠心病的急症，血栓性事件是心肌梗死发生的关键。凝血因子Ⅻ（FⅫ）是内源凝血途径的启动因子，主要由肝脏合成。目前普遍认为FⅫ并不是机体生理性凝血过程及止血机制所必需的凝血因子，FⅫ缺乏患者无临床出血症状。血浆FⅫ活性与FⅫC46T基因多态性有关[1]。关于FⅫC46T基因多态性及血浆FⅫ活性（FⅫ:C）水平与心肌梗死的相关研究多有报道[2-3]，但结果不尽相同。最近有研究资料显示[4]，抑制FⅫ可以阻遏血栓形成，使FⅫ作为靶点的抗栓物质成为现代抗栓研究的新热点。本研究通过观察AMI患者FⅫC46T基因多态性的分布和急性发作时血浆FⅫ:C的变化，以探讨FⅫC46T基因多态性与AMI的关系及血浆FⅫ:C变化对AMI的意义。

1 对象和方法

1.1 对象 AMI组97例为2014年2至7月在我院心内科住院患者，其中男63例，女34例，年龄29～87（65.67±12.81）岁。AMI的诊断均按照世界卫生组织对心肌梗死的诊断标准。所有患者均行冠脉造影术证实，其中75例患者术中植入支架，所有患者排除肝脏病变。对照组76例，选自2014年4至7月我院健康体检者，其中男49例，女27例，年龄31～80（64.55±9.45）岁；经病史询问、体格检查及实验室检查均未见异常，并排除心脑血管疾病史和患病家族史。两组之间均无亲缘关系。两组性别及年龄构成差异均无统计学意义(χ2=0.004，t=0.660，均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 AMI患者入院后在做冠脉造影术前，即刻抽取静脉血，以0.109mol/L枸橼酸钠1：9抗凝，3 000r/min离心10min，取上层贫血小板血浆，分装于eppen-droft管，并保存于-70℃低温冰箱待测；同时用DNA提取试剂盒（上海赛百盛公司产品）抽提下层单个核细胞的基因组DNA，置-70℃冰箱保存。

1.2.2 FⅫ基因第46位多态性检测 采用直接测序法。根据美国NCBI基因库所公布的FⅫ基因序列（Gen-Bank AF538691）设计引物，由上海生工生物工程有限公司合成。上游：5′-CCAGTCCCACTATCTAGAAAAG-3′，下游：5′-CTATCACAGCCATGAGCCAT-3′。聚合酶链反应（PCR）试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，PCR扩增如下：95℃预变性5min，然后95℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃延伸10min。PCR产物大小为594 bp，取PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳观察结果，并将PCR产物原液送上海生工生物工程有限公司测序。用Chromas软件将测序结果与FⅫ基因序列进行比对，确定第46位碱基多态性。

1.2.3 血浆FⅫ:C检测 使用法国STAGO-STA自动血凝仪采用一期凝固法进行检测（配套试剂由法国STAGO公司提供）。

1.3 统计学处理 应用SPSS18.0统计软件。计量资料以表示，两组样本均数比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。基因型和等位基因频数采用直接计数法统计，组间比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 两组FⅫC46T基因型和等位基因频数分布比较 见表1。

表1 两组FⅫC46T基因型和等位基因频数分布比较[例（%）]

由表1可见，FⅫ基因C46T多态位点TT、CT、CC 3种基因型在两组中的分布差异无统计学意义（χ2=0.715，P＞0.05），且C、T等位基因频率在两组中的分布亦无统计学差异（χ2=0.486，P＞0.05）。

2.2 两组不同基因型血浆FⅫ:C水平比较 见表2。

表2 两组不同基因型血浆FⅫ:C水平比较（%）

由表2可见，AMI患者血浆FⅫ:C水平TT基因组明显低于CT组和CC组（P＜0.01），且CT组活性低于CC组（P＜0.01）。对照组不同基因组间血浆FⅫ:C水平类似AMI组。AMI组血浆FⅫ:C水平显著低于对照组（P＜0.01）。

3 讨论

心肌梗死是炎症参与的斑块破裂和血栓形成导致的急性心肌缺血坏死。目前国内研究FⅫC46T多态性与AMI之间相关性报道极少，国外主要集中于欧洲各国，且结论各不相同。本研究对FⅫ因子启动区的第46位碱基多态性进行直接测序，发现AMI组和对照组均以TT基因型为主，且T等位基因频率较高，与国内云南汉族人群分布情况类似[5]，但与欧洲人群分布截然不同[3]，提示FⅫ基因46位多态性分布存在种族地域差异。FⅫC46T3种基因型和等位基因C、T在AMI组和对照组间的分布差异均无统计学意义（均P＞0.05），表明AMI与FⅫC46T基因型并无关联。而Roldan等[2]则认为FⅫ46 T等位基因将增加患早发性MI风险，特别是高胆固醇血症人群。本研究中血浆FⅫ:C检测结果显示：不论正常人群还是AMI患者，CC、CT和TT 3种基因型对应的血浆FⅫ:C水平均有统计学差异，以CC组活性最高，TT组活性最低，表明T等位基因与低水平血浆FⅫ:C相关联。其原因为T等位基因创造了一个新的甲硫氨酸起始密码子，破坏了启动子区域的一个Kozak共有序列，导致FⅫ翻译效率下降[1]。

本实验结果亦显示：AMI患者总体血浆FⅫ:C水平（80.08%）显著低于正常对照（91.03%），但T等位基因频率在AMI组（73.7%）和对照组（77.0%）的分布并无显著差异，提示AMI患者血浆FⅫ:C水平下降并非是T等位基因所致，原因可能为消耗性降低。瑞典一研究报道ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者发病6h内体内FⅫa/AT复合物水平显著高于正常对照，1～3d趋于正常，但两者水平均明显高于3个月后的自身水平，这一结果证实STEMI发病即血栓形成和FⅫ参与密切相关[6]。与此同时，在最近几年中，大量的动物实验或是运用寡反义核苷酸（ASO）技术下调FⅫ表达或通过阻遏FⅫ的激活物或应用抗体直接抑制FⅫa的催化活性均能不同程度地抑制动、静脉血栓形成[4，7-8]。由此可见，FⅫ在病理性血栓形成中起重要作用，FⅫ缺乏可能是预防血栓形成的保护性因素。尽管目前大部分研究都局限于动物实验,但对将来研发新的、更安全的抗血栓治疗药物具有重大意义。

综上所述，FⅫC46T基因多态性与AMI无关联，AMI急性发作时血浆FⅫ:C显著降低，FⅫ水平与血栓形成密切相关。FⅫ缺乏可能是预防血栓形成的保护性因素，此观点有待进一步研究证实。

[1]Endler G,Exner M,Mannhalter C,et al.A common C→T polymorphism at nt 46 in the promoter region of coagulation factorⅫis associated with decreased factorⅫactivity[J].Thromb Res, 2001,101(4):255-260.

[2]Roldan V,CorralJ,Marin F,et al.Synergistic association between hypercholesterolemia and the C46T factorⅫ polymorphism for developing premature myocardial infarction[J].Thromb Haemost, 2005,94(6):1294-1299.

[3]Bach J,Endler G,Winkelmann B R,et al.Coagulation factorⅫ(FⅫ)activity,activated FⅫ,distribution of FⅫC46T gene polymorphism and coronary risk[J].Thromb Haemost,2008,6(2):291-296.

[4]Worm M,Kohler E C,Panda R,et al.The factorⅫa blocking antibody 3F7:a safe anticoagulant with anti-inflammatory activities [J].Ann TranslMed,2015,3(17):247-251.

[5]齐林,李建美,孙浩,等.云南汉族心肌梗死相关基因的多态性研究[J].中华医学遗传学杂志,2012,29(4):413-419.

[6]Christensen K,Kozarcanin H,EkdahlK N,et al.Evidence of contact activation in patients suffering from ST-elevation myocardial infarction[J].Thromb Res,2016,141:158-162.

[7]Revenko A S,Gao D,Crosby J R,et al.Selective depletion of plasma prekallikrein or coagulation factorⅫinhibits thrombosis in mice without increased risk of bleeding[J].Blood,2011,118(19): 5302-5311.

[8]Travers R J,ShenoiR A,Kalathottukaren M T,et al.Nontoxic polyphosphate inhibitors reduce thrombosis while sparing hemostasis[J].Boold,2014,124(22):3183-3190.

Association between coagulation factorⅫ gene polymorphisms and acute myocardial infarction

LIU Meina,JIN Yanhui,CHENG Shuibing，et al.Laboratory Medicine Center，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325015，China

【 Abstract】 Objective To investigate the association between genetic polymorphisms of coagulation factorⅫ (FXII)with acute myocardial infarction(AMI). Methods The blood samples of 97 cases of AMI patients before treatment and 76 healthy subjects were obtained.The FⅫC46T Polymorphism was analyzed by direct sequencing.Plasma coagulation factorⅫactivity(FⅫ:C)was measured by one-stage recalcification clotting time assay.The association between FXII gene polymorphism and susceptibility of AMI was analyzed. Results There were no significant differences in FXII C46T genotype CC,CT,TT distribution and C,T allele frequency between two groups(P＞0.05).Subjects with homozygous T allele showed significantly lower plasma FⅫ:C compared to subjects with homozygous C allele or those with heterozygous C/T allele(P＜0.01).Compared with control group,Plasma FⅫ:C in AMI group was significantly lower(P＜0.01). Conclusion The FⅫC46T polymorphism may be not related to AMI,while AMI is associated with reduced plasma FⅫactivities.

Myocardial infarction FactorⅫ Gene polymorphism

2016-05-03）

（本文编辑：沈昱平）

温州市科技计划项目（Y20140407）

325015 温州医科大学附属第一医院医学检验中心（刘媚娜、金艳慧、徐琦煜、刘欢乐、王明山），创伤外科（程水兵）

王明山，E-mail:wywms@126.com