Fn14-shRNA慢病毒载体的制备

于 涛，杨云峰，李 兵，陈 凯，朱 辉，张明珠，赵有光，俞光荣

同济大学附属同济医院骨科，上海 200065

Fn14-shRNA慢病毒载体的制备

于 涛，杨云峰，李 兵，陈 凯，朱 辉，张明珠，赵有光，俞光荣

同济大学附属同济医院骨科，上海 200065

目的 构建Fn14-shRNA慢病毒载体，以进一步进行动物实验，研究Fn14在骨肉瘤中的表达和作用。方法 使用RNA干扰技术，构建Fn14干扰载体、病毒包装、感染细胞，并进行鉴定。结果 Fn14-shRNA干扰质粒单酶切验证阳性，测序结果与设计完全一致，干扰组Fn14在稳转细胞株中表达下调。结论 成功构建了Fn14-shRNA慢病毒载体，为进一步从分子水平探讨Fn14在骨肉瘤中的生物学作用奠定了基础。

骨肉瘤；细胞表面受体成纤维细胞生长因子诱导14；RNA干扰；慢病毒

细胞表面受体成纤维细胞生长因子诱导14 （Fn14）是一种Ⅰ型跨膜蛋白，最初以肿瘤坏死因子样细胞凋亡弱诱导剂（TWEAK）受体的身份被人们发现。经证实，TWEAK与Fn14结合后可激活下游通路，进而诱导某些肿瘤细胞凋亡[1]，促进肿瘤细胞生存和增殖[2]，提高肿瘤细胞侵袭力[3]，诱导肿瘤血管的形成[4]，促炎性反应并藉此通过炎性递质的调控促进肿瘤播散和转移[5-6]。Fn14在乳腺癌、神经胶质瘤、肠腺癌和肝癌等多种恶性肿瘤中异常表达[7-10]，且在其配体TWEAK表达量很低甚至不表达的情况下亦可激活下游通路[11]，发挥其生物学作用，故Fn14是一个与很多恶性肿瘤发生相关的关键分子。因此它可能也在骨肉瘤的发生、发展中发挥重要作用，是一种潜在的治疗骨肉瘤的新型分子靶向。然而，Fn14在骨肉瘤中是否表达异常、具有何种生物学作用等却未见报道。

本研究主要通过Fn14-shRNA干扰重组慢病毒载体的制备和慢病毒包装，用慢病毒介导的基因转移方法建立Fn14基因下调的稳转U-2OS细胞株，以对其进行下一步骨肉瘤细胞生物学行为的检测。

1　材料与方法

1.1材料

①质粒为慢病毒主质粒pLKO.1-TRC；慢病毒载体系统，该病毒包装系统为三质粒系统，由pLKO.1-TRC、psPAX2和pMD2.G组成，其中，pLKO.1-TRC具有PURO抗性，用于稳转筛选，psPAX 2和pMD2.G含有病毒包装所必须的元件；②菌株：大肠杆菌DH5a；③细胞系：293T为美国ATCC来源人胚肾细胞系，用含10%胎牛血清的DMEM于37℃、CO2体积分数为5%的条件下培养；④试剂和试剂盒：DMEM培养基[High glucose，4 500mg/LGlucose，4.0mmol/LL-Glutam ine，110mg/ L Sodium Pyruvate；1/100（v/v）Penicillin/strepen （Gibco 15140-122）]、10%胎牛血清均购于美国Gibco公司，质粒DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自天根生化科技有限公司，1st strand cDNA Synthesis Kit、限制性内切酶BamHI、EcoRI和1kb plus DNAMarker均购自TAKARA公司，DNA聚合酶PFU酶、T4 DNA连接酶均购自天根生化科技有限公司，转染试剂 Lipofectam ineTM2000购自Invitrogen公司；⑤ 实验仪器：荧光定量PCR仪（ABI 7500型），RNA/DNA calculator（Pharmacia公司），高速冷冻离心机（BECKMAN公司），Mastercycler 96孔 PCR仪（Eppendorf公司），DYY-6C型稳流稳压电泳仪（北京六一仪器厂），Gel Doc 1000凝胶成像系统（BIO RAD），CO2恒温培养箱（Nuaire）。

1.2方法

1.2.1 Fn14干扰载体的构建

根据Genebank报道的FN14的mRNA序列和相关文献报道，从基因起始密码子下游寻找符合设计特征的靶序列。其美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）号为NM_016639.2。经BLAST Search检索确认与其他的人类已知基因序列无同源性。然后针对靶点序列，将转录出shRNA的DNA双链从茎环处设计为两段。根据siRNA序列，设计成针对其编码区核苷酸碱基序列的1对寡核苷酸链。其顺序依次为21nt的正义序列、9nt的loop插入序列、21nt的反义序列和转录终止信号。FN14-shRNA片段1：ACCGGTCGGACCTGGACAAGTGCATTTCAAGAGAATGCACTTGTCCAGGTCCGTTTTTTGAAT TC；FN14-shRNA片段2：AATTCAAAAAACGGACCTGGACAAGTGCATTTCAAGAGAATGCACT TGTCCAGGTCCGA；NC-shRNA片段1：CCGGAGCGACTGTGCCAATTCCATTCTC GAGAATGGAATTGGCACAGTCGCTTTTTTG；NC-shRNA片段2：AATTCAAAAAAAGCGACTGTGCCAATTCCATTCTCGAGAATGGAATTGGCACAGTCGC。

shRNA双链的制备。合成单链DNA oligo，把片段1、片段2干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15 m in，然后自然冷却至室温，使其复性成双链。plko.1-TRC载体双酶切及回收、连接转化、质粒抽提，步骤如上。单酶切鉴定：利用该内切酶EcoRI对重组质粒进行单酶切反应。酶切产物进行琼脂糖电泳，如果电泳条带单一，且大小适当，表明该质粒克隆为阳性，否则为阴性。测序鉴定：此抽提质粒测序由上海博尚生物技术有限公司进行。测序引物为：CACGCTGTTTTGACCTCCATAGAA。

1.2.2 Fn14干扰病毒包装

慢病毒包装细胞转染用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，重新接种于10m L的10 cm2细胞培养皿，在37℃、CO2体积分数为5%的培养箱内培养；当细胞融合度达90%～95%时转染。先吸去培养基，然后用无菌的PBS洗1次，然后加入5m L无血清培养基。制备慢病毒包装系统中三种质粒DNA溶液：加入DMEM至500μL，室温放置5m in；另外取一无菌EP管，加入450μL的DMEM，然后加入50μL脂质体Lipofectam ineTM2000，室温放置5 m in。然后将脂质体缓慢的加入质粒DNA中，混匀，室温放置20m in。将DNA和脂质体混合液转移至含单层细胞的培养液中，混匀，培养6 h后弃去含有转染混和物的培养液，加入10m L的PBS，轻摇后弃去，重复该步骤3次；每瓶细胞中加入含10%胎牛血清的细胞培养液10m L，继续培养；当细胞培养基变黄时，收集转染的293T细胞上清液；重新加入新鲜含10%胎牛血清的细胞培养液，继续收集病毒。在48和72 h时收集2次。将收集的上清液于4℃，4 000×g离心10m in，收集上清液；将上清液以0.45μm滤器过滤上清液于40m L超速离心管中。50 000×g超离心1.5 h。收集离心所得沉淀即为慢病毒粒子，用1m L的PBS液稀释慢病毒备用。使用实 时 定 量 PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法测定滴度。

感染细胞：接种目的细胞于6 cm培养皿中，当细胞融合度达到30%～45%左右时，加入2m L的病毒上清，同时加入3m L含10%胎牛血清的细胞培养液，加入polybrene至终浓度6μg/m L，24 h后更换为正常培养基。若48 h能长到80%～90%视为稳定生长，荧光显微镜观察慢病毒感染效率。3 d后观测GFP表达情况，然后做流式筛选GFP阳性细胞为稳转株，将细胞移至96孔板进行培养，然后进行放大培养，依次为96孔板、24孔板、6孔板，6 cm细胞培养皿，10 cm细胞培养皿，冻存细胞。制备不携带干扰基因的空载组细胞，未进行任何处理的骨肉瘤细胞为对照组。

稳转细胞株的鉴定：使用Western blot和qRT-PCR技术对稳转细胞株、空载组和对照组中Fn14的表达含量进行检测，具体方法同前。

2　结果

2.1测序结果

Fn14-shRNA干扰质粒单酶切验证阳性，测序结果与设计完全一致，质粒构建成功（图1、2）。

图1　Fn14-shRNA单酶切验证结果Fig.1 Resu ltsof single restriction enzym e verification

图2　Fn14-shRNA测序结果Fig.2 Fn14-shRNA sequencing resu lts

2.2无关对照慢病毒载体NC-shRNA插入序列

无关对照慢病毒载体NC-shRNA插入序列为CCGGAGCGACTGTGCCAATTCCATTCTCGAGA ATGGAATTGGCACAGTCGCTTTTTTGAATTC，NC-shRNA测序结果与设计完全一致，表明对照干扰载体已经构建成功（图3）。

图3　NC-shRNA对照载体测序结果Fig.3 NC-shRNA sequencing results

2.3滴度检测结果

加入不同病毒量的细胞样品，通过提取总RNA后反转录为cDNA，然后进行定量PCR检测，通过比较对照组和试验组的Ct值差异判断滴度值（表1）。绘制的Puro的溶解曲线如下（图4）。绘制的Actin的溶解曲线如下（图5）。

图4　抗生素抗性基因Puro溶解曲线Fig.4 Solubility curve of antibiotic resistance gene Puro

图5　内参Actin熔解曲线Fig.5 Solubility curve of internal reference Action

表1　抗生素抗性基因Puro及内参检测的Ct值Tab.1 Ctvaluesof antibiotic resistance gene Puro and internal reference

2.4稳转细胞株的鉴定结果

通过Western blot技术对干扰组、空载组和对照组三组细胞株中Fn14的含量进行检测，比较三组间的数值差异，使用SPSS 17.0，经方差分析（三组间方差检验齐性），三组间差别有统计学意义（F=69.48，P＜0.000 1）两两比较发现干扰组与对照组和空载组均差异均有统计学意义（P＜0.05），而空载组和对照组间差别无统计学意义（P＞0.05）。干扰组Fn14表达量较其他两组低（图6、7，表2）。

图6　Western blot电泳结果Fig.6 ResultsofWestern blot

图7　根据W estern b lot统计数据绘制的Fn14相对表达量统计图Fig.7 The relative expression of Fn14 according to Western blot results

表2　对照组、空载组及干扰组的化学发光与内参的灰度系数比Tab.2 Gamm a ratio of controlgroup，no-load group and interference group com pared w ith internal reference

通过Realtime qPCR技术对干扰组、空载组和对照组三组细胞株中Fn14的含量进行检测，比较三组间的数值差异，使用SPSS 17.0，经方差分析（三组间方差检验齐性），三组间差别有统计学意义（F= 27.22，P=0.001）两两比较发现干扰组与对照组和空载组均差异均有统计学意义（P＜0.05），而空载组和对照组间差别无统计学意义（P＞0.05）。干扰组Fn14表达量较其他两组低（表3、图8）。

表3　标准化后的CT值Tab.3 Standardized CT values

3　讨论

RNA干扰（RNA interference，RNAi）指在进化过程中高度保守的、双链RNA诱发的同源mRNA特异性降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型[12]。此技术可以此阻碍特定基因的翻译或转录，高效特异地抑制某特定基因表达，达到基因敲除的效果，故被广泛应用于基因功能和恶性肿瘤治疗研究，具有高效、特异等特点。

RNAi是通过一些稳定的中间递质来实现的，首先双链RNA降解为较小的RNA分子，尔后他们序列互补与mRNA结合，从而使得mRNA降解。长度21～23 nt的小RNA分子正是引起RNA干扰的直接原因，被称为小干扰RNA（siRNA）[13-14]。siRNA的制备有多种方法，包括体外制备和体内表达两大类。体外制备需要专门的RNA转染试剂将siRNA转到细胞内，而体内表达则是转染的细胞的DNA模板在体内转录得到siRNA。体外制备方法主要包括化学合成、体外转录和长片段dsRNAs经RNaseⅢ类降解。体内表达主要有siRNA表达载体或病毒载体在细胞中表达siRNA和PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达。其中除长片段dsRNAs经RNaseⅢ类降解法外，均需要单独设计siRNA序列。化学合成方法相对价格较为昂贵，对细胞和动物都存在一定毒性，定制周期长，无法长期产生基因沉默的效果，故本实验未采用。体外转录以DNA Oligo为模板，通过体外转录合成siRNA，其成本相对于化学合成较低，而且获得siRNA更快，但是反应的规模和量受到限制，最适合用于筛选siRNA，特别是需要制备多种siRNA时，故本实验也没用使用此方法。用RNaseⅢ消化长片段双链RNA制备siRNA，无需设计和检验多个siRNA序列以找到有效的siRNA，但是本方法有可能引发非特异性的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因，本方法不适用于需要一个特定siRNA进行的研究，在本研究中也没有采纳。siRNA表达框架由PCR得到siRNA表达模板，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中，但是PCR产物很难转染到细胞中，转染效率有待于进一步提高，更适合于筛选siRNA序列，所以本研究也未使用此方法。而siRNA表达载体可以在哺乳动物细胞中表达更多的siRNA，适合已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间基因沉默的研究，故本实验采纳此方法。

慢病毒载体是以人类免疫缺陷病毒-1为来源的一类病毒载体，属于反转录病毒科，其包含了包装、转染和稳定整合所需的遗传信息。携带有外源性基因的慢病毒载体在包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。慢病毒载体可以感染非分裂期的细胞，在非有丝分裂细胞中复制，且能够稳定长期表达，已经广泛应用于RNA干扰中。

Fn14是TWEAK的受体，是一种Ⅰ型跨膜蛋白，TWEAK与其结合后会激活下游通路，从而引发一系列的生物学效应。Fn14已被证实在多种恶性肿瘤中表达异常，且被激活后有可能刺激肿瘤细胞增殖、分化和迁移[1-3]，调节肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤血管生成的作用[4]，是多种恶性肿瘤发生发展中的一个重要调节因子[5-6]。而对于恶性程度较高且发病机制尚不清楚的骨肉瘤中，Fn14的表达情况和生物学意义未有报道。在Pubmed公开的基因芯片数据中显示，Fn14在骨肉瘤中表达较正常骨组织显著增高，这说明Fn14有可能在骨肉瘤的发生发展中发挥一定作用。本研究我们使用RNA干扰技术下调Fn14基因在骨肉瘤细胞中的表达，并经鉴定病毒包装和稳转细胞株构建成功。这为进一步通过侵袭实验、增殖实验或凋亡实验等研究Fn14在骨肉瘤细胞中发挥的具体作用奠定了基础。

本实验首先根据既往文献报道的mRNA序列，从基因起始密码子下游寻找合适的符合设计特征的靶序列，合成shRNA双链，并进行单酶切鉴定和测序鉴定。Fn14-shRNA干扰质粒单酶切电泳验证为阳性，测序结果与设计一致，质粒构建成功；而NC-shRNA测序结果也与设计完全一致，说明对照的干扰载体也已经构建成功。

进而下一步加入不同病毒量的细胞样品，提取总RNA后反转录，得到cDNA，再进行定量PCR检测，得出滴度值＞3.00×109TU/m L。本研究中的溶解曲线做图没有出现杂峰，也未出现主峰的异常增宽，表明实验中未出现污染、引物二聚体和非特异性扩增。

在对稳转细胞株构建的鉴定中，我们使用qRT-PCR和Western blot技术，经检测Fn14在稳转细胞株中表达下调，结果有统计学意义，Fn14-shRNA稳转细胞株构建成功。

本研究成功构建了Fn14-shRNA慢病毒载体，携带的干扰序列可以通过病毒感染整合到细胞基因组中，可以使用该方法得到的稳转细胞株进行Fn14的功能研究，对进一步开展增殖、凋亡、侵袭及动物实验有重要意义。

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Construction and identification of Fn14-shRNA lentiviralvector

YU Tao，YANG Yunfeng，LIBing，CHEN Kai，ZHU Hui，ZHANGM ingzhu，ZHAO Youguang，YU Guangrong
DepartmentofOrthopaedics，TongjiHospital，TongjiUniversity School ofMedicine，Shanghai 200065，China

ObjectiveTo construct Fn14-shRNA lentiviral vector to further investigate the expression and biological significance of Fn14 in osteosarcomaw ith animal experiment.M ethods Fn14-shRNA vectorwas constructed by RNA interference technique，and viral packaging，cell co-transfection，and indentification were conducted.Results The single enzyme detection was positive，and the sequencing result was consistent w ith design.Fn14 was downregulated in stably transfected cell lines.Conclusion Fn14-sh RNA lentivirus recombinant vectors are successfully constructed，which lays the foundation for further study of the biologicalsignificance of Fn14 in osteosarcoma.

Osteosarcoma；Fibroblastgrow th factor-inducible14；RNA interference；Lentiviral

R681

A

2095-378X（2016）02-0096-06

10.3969/j.issn.2095-378X.2016.02.008

于涛（1985—），男，住院医师，博士，研究足踝外科、骨科创伤、骨肿瘤

俞光荣，电子信箱：yuguangrong@hotmail.com

（2016-01-18）