复方灵芝口服液对睡眠剥夺大鼠学习记忆的影响及机制

周彦娜，薄世兴，邓 飞，陶婷婷，黄厚今

(1. 遵义医学院 公共卫生学院流行病学与统计学教研室，贵州 遵义 563099；2. 遵义医学院附属医院 干部保健病房, 贵州 遵义 563099；3. 遵义医学院 基础医学院组织学与胚胎学教研室，贵州 遵义 563099；4. 遵义医药高等专科学校 卫生管理系，贵州 遵义 563000；5. 遵义医学院 公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，贵州 遵义 563099)



基础医学研究

复方灵芝口服液对睡眠剥夺大鼠学习记忆的影响及机制

周彦娜1，薄世兴2，邓 飞3，陶婷婷4，黄厚今5

(1. 遵义医学院 公共卫生学院流行病学与统计学教研室，贵州 遵义 563099；2. 遵义医学院附属医院 干部保健病房, 贵州 遵义 563099；3. 遵义医学院 基础医学院组织学与胚胎学教研室，贵州 遵义 563099；4. 遵义医药高等专科学校 卫生管理系，贵州 遵义 563000；5. 遵义医学院 公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，贵州 遵义 563099)

目的 探讨复方灵芝口服液对睡眠剥夺大鼠学习记忆的影响及机制。方法 雌性SD大鼠50只，随机分为5组(n=10)：正常对照组 (C组)、睡眠剥夺模型组(M组)、复方灵芝口服液低(0.15 g/kg，GL组)、中(0.75 g/kg，GM组)、高剂量(1.5 g/kg，GH组)干预组。腹腔注射氯苯丙氨酸(PCPA)制造睡眠剥夺模型，Morris水迷宫检测大鼠的学习记忆能力，比色法检测血清MDA含量及SOD活力，Western Blot法检测大鼠脑组织海马区p-p38MAPK蛋白的表达。结果 根据行为学观察确定大鼠睡眠剥夺模型的成功。Morris水迷宫实验中，M组大鼠穿越平台的次数较正常对照组明显减少(P<0.05)，而GH组寻找平台的潜伏期较M组明显缩短(P<0.05)。血清SOD活力和MDA含量的检测结果显示，与C组相比，M组大鼠血清SOD活力明显减少(P<0.05)、MDA含量明显增加(P<0.05)；与M组相比，复方灵芝口服液各剂量组血清SOD活力均明显增加(P<0.05)，而MDA含量均明显减少(P<0.05)。脑组织海马区p-p38MAPK蛋白表达检测结果表明，M组较C组明显增加(P<0.05)，而复方灵芝口服液各剂量组p-p38MAPK 蛋白的表达比M组均明显减少(P<0.05)。结论 复方灵芝口服液可改善睡眠剥夺大鼠的学习记忆功能，其机制可能与减弱氧化应激和抑制P38MAPK信号通路有关。

复方灵芝口服液；睡眠剥夺；学习记忆；抗氧化；P38MAPK

睡眠剥夺是现代生活中的一种常见状态，主要表现为睡眠减少。睡眠减少可以激发器官功能的改变，包括免疫功能、学习记忆功能和内分泌功能[1]。因此研究睡眠剥夺现象及减轻睡眠剥夺对机体造成的损害已成为当今研究的热点。有研究报道具有抗氧化活性和提高学习记忆功能的药物可明显减轻睡眠剥夺对学习记忆的损害[2-3]，如红景天、维生素E；另有研究证实，睡眠剥夺对大鼠学习记忆的影响与P38丝裂原蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinases, 即P38MAPK)的活化有关[4]。复方灵芝口服液中的主药，灵芝[5-6]具有较强的抗氧化活性及改善睡眠和学习记忆的作用，我们的实验目的是探讨该口服液能否改善睡眠剥夺大鼠的学习记忆功能，并分析其作用机制是否与抗氧化和P38MAPK信号通路有关。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、仪器和药品 复方灵芝口服液(贵州吉仁堂药业有限公司)，氯苯丙氨酸(PCPA，美国Sigma公司)，MT-200型Morris水迷宫(成都泰盟科技有限公司)，729分光光度计(上海奥析科学仪器有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，p-p38MAPK (上海斯信生物科技有限公司)，GAPDH (Fermentas，Canada) 。

1.2 实验方法 健康SPF级雌性SD大鼠，体重180～200 g，由第三军医大学大坪医院动物中心提供，合格证号：SCXK(渝)2012-0005。光照每12 h明暗交替，自由饮食，实验前适应性饲养5 d。大鼠随机分为5组：正常对照组(C组)、睡眠剥夺模型组(M组)、复方灵芝口服液干预低(GL)、中(GM)和高剂量 (GH) 组，每组大鼠10只。干预组分别按照复方灵芝口服液人用剂量的3倍、15倍和30倍 (即0.15、0.75和1.5 g/kg)灌胃给药，C和M组灌胃同等体积的去离子水，每天1次，连续灌胃14 d后，除C组大鼠腹腔注射同等体积的生理盐水外，其余各组大鼠连续2 d每天腹腔注射PCPA300 mg/kg制造睡眠剥夺模型[7]。当大鼠出现烦躁不安、昼夜节律失调视为造模成功。造模成功后行Morris水迷宫实验[8]，检测大鼠的学习记忆能力。测试结束后处死大鼠，腹主动脉取血，离心 3 000 rpm，10 min，制备血清。采用比色法检测大鼠血清SOD活力及MDA含量，取脑组织海马区Western Blot法检测p-p38MAPK蛋白的表达。

2 结果

2.1 复方灵芝口服液对大鼠的学习记忆能力的影响 Morris水迷宫实验结果由表1可见，模型组穿越平台的次数较正常对照组明显减少(P<0.05)，而复方灵芝口服液高剂量组寻找平台的潜伏期较模型组明显缩短(P<0.05)，提示复方灵芝口服液高剂量对睡眠剥夺大鼠的学习记忆能力有改善作用。

组别给药剂量(g/kg)寻找平台潜伏期(s)穿越平台的次数C018．01±12．0026．60±5．68M023．06±11．8918．30±2．67aGL0．1521．12±10．1720．20±4．29GM0．7514．45±5．8320．50±5．74GH1．510．75±4．52b23．20±7．56F潜伏期：F=5．597；穿越平台的次数：F=3．509P潜伏期：P<0．001；穿越平台的次数：P=0．014

a：与C组比较，P<0.05；b：与M组比较，P<0.05。

2.2 抗氧化指标检测结果 大鼠血清SOD活力和MDA含量检测结果(见表2)，模型组SOD活力较正常对照组明显减少 (P<0.05)，血清MDA含量明显增加(P<0.05)；复方灵芝口服液各剂量组的SOD活力均较模型组明显增加(P<0.05)，且高剂量组明显高于低剂量组(P<0.05)；给药干预各剂量组MDA含量较模型组均明显减少(P<0.05)，且高剂量组较低、中剂量组明显减少(P<0.05)。

组别给药剂量(g/kg)SOD活力(U/mL)MDA含量(nmol/mL)C0128．95±27．685．77±0．82M090．36±31．03a7．41±1．45aGL0．15146．31±31．76b5．78±0．76bdGM0．75169．24±42．57b5．49±1．33bdGH1．5193．80±17．83bc3．42±0．79bFSOD活力：F=15．948；MDA含量：F=17．665PSOD活力：P<0．001；MDA含量：P<0．001

a：与C组相比，P<0.05；b：与M组相比，P<0.05；c：与GL组相比，P<0.05；d：与GH组相比，P<0.05。

2.3 大鼠脑组织海马区p-p38MAPK蛋白的检测结果 图1、表3可见，模型组p-p38MAPK蛋白的表达较正常对照组明显增加(P<0.05)，复方灵芝口服液各剂量组的表达较模型组均明显减少(P<0.05)，且给药干预高剂量组蛋白的表达较低、中剂量组明显减少(P<0.05)。

图1 大鼠脑组织海马区p-p38MAPK蛋白的表达

组别给药剂量(g/kg)p-p38MAPK蛋白C00．81±0．14M01．22±0．17aGL0．150．93±0．21bcGM0．750．91±0．12bcGH1．50．47±0．08bF32．584P<0．001

a：与C组相比，P<0.05；b：与M组相比，P<0.05；c：与GH组相比，P<0.05。

3 讨论

睡眠剥夺模型的成功建立是整个研究的关键点，其建立方法是否可靠直接影响研究的成败。目前已有不少实验采用PCPA睡眠剥夺模型[7,9]，观察模型是否成功主要通过行为观察法，即首次注射后28～30 h观察发现大鼠出现昼夜节律消失，白天夜晚活动不停，而空白对照组昼夜节律正常，认为造模成功。本研究采用化学物质氯苯丙氨酸(PCPA)腹腔注射300 mg/kg，连续注射2 d后，除C组昼夜节律正常外，其余各组均有不同程度的昼夜节律异常，活动增多，表示造模成功。

Morris水迷宫是检测动物学习记忆功能的经典方法之一，寻找隐匿平台可较客观反映动物的空间学习记忆能力。经实验发现，模型组穿越平台的次数较正常对照组明显减少，说明睡眠剥夺可降低大鼠的学习记忆能力，这与之前的报道结果一致[10-11]； 复方灵芝口服液高剂量组潜伏期较模型组明显缩短，说明高剂量复方灵芝口服液可改善睡眠剥夺大鼠的学习记忆能力，这与使用具有抗氧化活性的药物红景天[2]可改善睡眠剥夺大鼠的学习记忆能力有相似之处。

其机制与以下方面有关。①血清SOD活力与MDA含量是反映体内氧化应激水平的重要指标。实验结果发现，睡眠剥夺可降低血清SOD活性，增加血清MDA的含量，说明睡眠剥夺可以激活机体的氧化应激系统，降低其清除自由基的能力，这与吴北峰等[12]关于睡眠剥夺的报道一致；而复方灵芝口服液各剂量组的血清SOD活力较模型组增加，MDA含量较模型组降低，说明给予复方灵芝口服液可明显减轻睡眠剥夺引起的氧化应激反应，减轻其对机体造成的损伤。因此，复方灵芝口服液的抗氧化作用可能是其减轻睡眠剥夺损害的机制之一。②P38MAPK是有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)家族成员之一，被激活后通过链式级联反应，激活转录因子ATF-2、Elk-1、CHOP10等，促进炎症因子、凋亡基因的表达，在中枢神经系统疾病中发挥重要作用。本实验数据证实，模型组脑组织海马区p-p38MAPK蛋白表达较正常对照组明显增加，说明睡眠剥夺可以激活P38MAPK信号通路，增加p-p38MAPK蛋白的表达，这与赵雅宁等[13]的报道一致；而给予复方灵芝口服液各剂量组的蛋白表达较模型组明显降低，说明复方灵芝口服液可明显降低p-p38MAPK蛋白的表达，其机制可能是通过抑制P38MAPK信号通路实现的，这也许是复方灵芝口服液减轻睡眠剥夺对机体造成损害的机制之一。

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[收稿2016-07-11;修回2016-09-19]

(编辑：王 静)

Effect and mechanism of compound Ganoderma lucidum oral liquid on learning-memory ability in sleep deprived rats

ZhouYanna1,BoShixing2,DengFei3,TaoTingting4,HuangHoujin5

(1.Department of Epidemiology and Statistics, School of Public Health, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2. Cadres Health Care Ward, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 3. Department of Histology and Embryology, School of Basic Medical Sciences, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 4. Department of Health Management, Zunyi Medical and Pharmaceutical College, Zunyi Guizhou 563000, China; 5. Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective To observe the effects of CompoundGanodermalucidumOral Liquid (CGLOL) on learning-memory ability of sleep-deprived rats, and explore the underlying mechanism. Methods Female SD rats were randomly divided into five groups of 10 each, they were group C (control group), group M (sleep deprivation model group) and CGLOL intervention group [group GL (0.15 g/kg), group GM (0.75 g/kg) , group GH (1.5 g/kg)]. After the model was established by receiving parachlorophenylalanine (PCPA) (300 mg/kg, i.p for 2 days.), Morris water maze was used to evaluate the learning-memory ability of rats, the content of serum MDA and the activity of serum SOD were determined by spectrophotometry, and the expression of p-p38MAPK protein by Western Blot. Results According to the observation of ethological indexes, the sleep deprivation model was successfully established. In Morris water maze, group M crossed the platform less times than group C (P<0.05), group GH spent shorter time finding the platform than group M (P<0.05); According to the results of serum SOD activities and the content of serum MDA,the serum SOD activities decreased markedly in group M (P<0.05), while the content of serum MDA increased (P<0.05); When compared with group M, the serum SOD activities increased in CGLOL intervention group, while the content of serum MDA decreased (P<0.05). What’s more, when compared with group C, the expression of p-p38MAPK protein in rat hippocampus increased significantly in group M (P<0.05), but decreased in CGLOL intervention group when compared with group M (P<0.05). Conclusion CompoundGanodermaLucidumOral Liquid may ameliorate the effect of learning-memory ability caused by sleep deprivation; these effects may be mediated by removing free radicals and inhibiting P38MAPK signaling pathway, and may be one of underlying mechanisms for CompoundGanodermaLucidumOral Liquid to relieve sleep deprivation

compoundGanodermalucidumoral liquid; sleep deprivation; learning-memory ability; antioxidant; P38MAPK

贵州省科学技术基金资助项目(NO: 黔科合J字[2013]05)；遵义医学院研究生教育创新计划项目(NO: 遵研创合字[CX201311])。

黄厚今，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：营养毒理，E-mail: huanghj6688@163.com。

R285.5

A

1000-2715(2016)05-445-04