广东地区非综合征型耳聋突变基因流行病学调查

王蒙 周枫 王兴君 林颖 朱美婵 于锋

广州市耳鼻咽喉头颈外科医院（广州市第十二人民医院）

广州医科大学耳鼻咽喉头颈外科研究所

·临床研究·

广东地区非综合征型耳聋突变基因流行病学调查

王蒙 周枫 王兴君 林颖 朱美婵 于锋

广州市耳鼻咽喉头颈外科医院（广州市第十二人民医院）

广州医科大学耳鼻咽喉头颈外科研究所

目的 揭示广东地区非综合征型耳聋（Non-syndromic hearing loss，NSHL）患者的分子病因构成，为规范标准的聋病筛查、预防及干预提供理论依据。方法对广东地区507例NSHL患者抽取外周静脉全血并提取基因组DNA，检测中国人群中常见的4个耳聋基因9个突变位点。结果507例NSHL患者共检出耳聋基因突变者115例（115/507，22.68%）。其中GJB2基因突变携带者48例，检出率9.47%（48/507）：包含c.235 del C纯合突变型6.31%（32/507），杂合突变型1.58%（8/507）；c.299 del AT纯合突变型0.20%（1/507），杂合突变型0.40%（2/507）；c.235 del C/c.299 del AT复合杂合突变型0.99%（5/507）。SLC26A4基因59例，检出率11.64%（59/507）：包含c.919-2 A＞G纯合突变型3.16%（16/ 507），杂合突变型6.11%（31/507）；c.2168 A＞G纯合突变型0.40%（2/507），杂合突变型1.38%（7/507）；c.919-2 A＞G/ c.2168 A＞G复合杂合突变型0.59%（3/507）。线粒体12S rRNA检出8例（8/507，1.58%），均为m.1555 A＞G均质型突变。结论SLC26A4是广东地区NSHL人群最主要的致聋基因，c.919-2A＞G为其突变热点；GJB2为引起该地区SNHL的第二位致聋基因，c.235delC为其突变热点。

非综合征型耳聋；基因检测；基因芯片

Acknowledgments：This study was supported by the Science and Technology Program of Guangzhou(2014Y2-00119).

We thank the patients,their families and deaf-mute school children who participated in this study.

The authors declare that they have no conflicts of interest.

遗传性耳聋已成为影响人类健康和生活质量的常见原因，50%的儿童期耳聋患者与遗传因素密切相关。遗传性耳聋根据是否合并其他系统器官疾病，分为综合征型耳聋（Syndromic deafness，SHL）和非综合征型耳聋（Non-syndromic hearing loss，NSHL）[1]，其中70%的遗传性耳聋表现为非综合征型耳聋。按遗传方式，可将NSHL分为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、X染色体连锁遗传和线粒体突变耳聋[2]，约80%的NSHL为常染色体隐性遗传[3]。

国内外大量耳聋分子流行病学研究表明：GJB2、SLC26A4和线粒体12S rRNA是引起我国非综合征型耳聋的常见基因，不同种族、不同地区的耳聋人群中致聋基因突变频率存在明显差异[4-8]。为了解广东地区非综合征型耳聋基因分子病因，本研究利用晶芯®九项遗传性耳聋芯片试剂盒（微阵列芯片）对广东地区非综合征型耳聋患者进行筛查与分析，明确该地区的热点致聋基因及其突变频率。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取广东地区（主要包括广州、中山、肇庆、珠海等地）聋人学校及语训中心的非综合征型耳聋患者507例，排除全身器质性病变或合并其他遗传疾病。其中男281例，女226例，年龄7～22岁（中位年龄13岁）。经声导抗、纯音听阈测试后，均为双侧重度或极重度感音神经性聋。在医生指导下填写《耳聋病人信息登记表》获取耳聋相关信息，包括患儿一般信息、出生史、耳聋发病年龄、家族史、个人史(耳聋前传染病史、耳毒性药物应用史、头部外伤史等)和母孕期情况等。所有患者或家长均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 主要仪器和试剂

血液基因组DNA提取试剂盒为晶芯®九项遗传性耳聋基因检测试剂盒（微阵列芯片法）购自北京天根生物工程有限公司，PCR仪（ABI 9700）、芯片杂交仪（Bio MixerTMⅡ）、芯片洗干仪（Slide Wash⁃erTM 8）、芯片扫描仪（Lux ScanTM 10K-B）购自北京博奥生物集团有限公司。

1.2.2 DNA提取

采集受检者外周血2mL，应用试剂盒提取DNA，试剂盒方法提取步骤参照试剂盒提供的使用说明进行。用核酸定量仪（紫外分光光度计）检测DNA浓度和纯度（浓度l00～200ng HL，纯度260nm/280nm= l.7～2.0）。标本保存于-20℃备用。

1.2.3 耳聋基因芯片检测方法

应用遗传性耳聋基因芯片检测试剂盒，对GJB2（c.235 del C、c.176 del 16、c.299 del AT和c.35 del G）、SLC26A4（c.919-2 A＞G、c.2168 A＞G）、线粒体12S rRNA（m.1494 C＞T、m.1555 A＞G）、GJB3（c.538 C＞T）4个基因9个突变位点进行检测。通过以人基因组DNA为模板，采用带有Tag标签序列的基因位点特异性引物对相关基因位点所在的基因片段进行扩增和荧光标记，与能够识别相应标签序列的通用基因芯片进行杂交。使用芯片扫描仪对结果进行判读。具体操作按试剂盒说明书步骤进行。

1.2.4 颞骨CT检查

对59例SLC26A4基因突变携带患者进行16排螺旋CT颞骨扫描，层厚/层距(mm):0.6/0.6，窗宽4000HU，窗位700HU，扫描范围以听眶上线为基线向上连续扫描。

2 结果

2.1 听力检查结果：根据纯音听阈结果显示，广东地区507例非综合征型耳聋患者中，重度感音神经性聋89例（17.55%）；极重度聋344例（67.85%）；全聋74例（14.60%）。

2.2 致聋基因突变检测结果

507例非综合征型耳聋患者中，共检出遗传性耳聋基因突变携带者115例（22.68%），67例患者明确为遗传性耳聋。其中检出GJB2基因突变携带者48例（48/507，9.47%）、SLC26A4基因突变携带者59例（59/507，11.64%）、线粒体12S rRNA突变携带者8例（8/507，1.58%）、未检出GJB3基因突变（表1）。GJB2和SLC26A4检出率最高（图1），两种基因突变携带数占基因突变携带总数的93.04%（107/115）。遗传性耳聋基因芯片检测结果见图2。

表1 广东地区507例SNHL患者耳聋基因突变检出率Table.1 507 cases of SNHL patients’deafness gene mutation detection rate in Guangdong District

图1 广东地区507例非综合征型耳聋患者耳聋相关基因突变检出比例图Fig.1 Scale map of 507 cases with SNHL patients’deafness gene mutation detection rate in Guangdong District

48例GJB2携带者均表现为极重度聋，c.235 del C纯合突变型检出率为6.31%（32/507），杂合突变型检出率为1.58%（8/507）；c.299 del AT纯合突变型检出率为0.20%（1/507），杂合突变型检出率为0.40%（2/507）；c.235 del C/c.299 del AT复合杂合突变型检出率为0.99%（5/507）(表2)。c.235 del C突变携带数占GJB2基因突变携带总数的93.75%（45/48）。c.235 del C的等位基因频率为7.59%（表3）。

59例SLC26A4携带者中，c.919-2 A＞G纯合突变型检出率为3.16%（16/507），杂合突变型检出率为6.11%（31/507）；c.2168 A＞G纯合突变型检出率为0.40%（2/507），杂合突变型检出率为1.38%（7/507）；c.919-2 A＞G/c.2168 A＞G复合杂合突变型检出率为0.59%（3/507）(表2)。c.919-2 A＞G突变携带数占SLC26A4基因突变携带总数的84.75%（50/59）。c.919-2 A＞G的等位基因频率为7.59%（表4）。颞骨CT诊断57例为前庭水管扩大，其中4例伴有双侧mondini畸形。

8例线粒体12S rRNA均为m.1555 A＞G均质型突变，检出率为1.58%（8/507）（表2）。

未检出GJB3基因突变。

图2 遗传性耳聋基因芯片检测结果Fig.2 Test of hereditary deafness gene chip

表2 广东地区507例NHSL患者耳聋基因突变检出结果Table 2 Mutation in 507 cases of SNHL patients’deafness in Guangdong District

3 讨论

中国地域广大、人口众多具有人群总体基因复杂、地域差异大的特点，因此在各地区开展耳聋基因筛查，分析各区域的热点突变特点，对完善我国耳聋基因分子病因构成，为规范标准的聋病筛查、干预及预防提供理论依据。本次调查主要包括广州、中山、肇庆、珠海等地的聋人学校及语训中心非综合征型耳聋患者507例，具有一定的地域代表性，为广东地区耳聋患者的致聋原因和热点突变基因研究提供了资料。

GJB2是引起我国非综合征型耳聋的主要致聋基因,可造成约50%的常染色体隐性遗传性非综合征性耳聋。据国内大规模耳聋流病学调查数据显示，中国人群的GJB2基因突变率约为21%[9,10],热点突变为c.233-235 del C,其次为c.299-300 del AT及c.176 del 16bp[11]。本研究的507例NSHL患者中GJB2总突变率为9.47%，低于我国普查均值。其中c.235 del C突变检出率最高为8.88%(45/507)；其次为c.299 del AT，检出率为1.58%（8/507）；未检测出c.35 del G、c.176 del 16bp突变。c.235 del C突变携带数占GJB2基因突变携带总数的93.75%（45/48），故将c.235 del C作为GJB2的热点突变。针对该热点突变，本文对比戴朴等（2007年）[12]的全国性调查数据可发现，广东地区热点突变频度与全国一致,c.235 de1 C在检测人群均有较高频率的变异性；但广东地区c.235 del C的等位基因频率为7.59%，低于戴朴等的调查数据（12.00%）。

SLC26A4是仅次于GJB2的引起我国非综合征性耳聋的致聋基因，总携带率约为14.5%[13,14]，可导致大前庭水管综合征和Pendred综合征，常见的位点为c.919-2 A＞G[15]和c.2168 A＞G。本研究中SLC26A4总突变率为11.64%，低于我国普查均值。而本次调查发现SLC26A4基因突变率高于GJB2是引起广东地区非综合征型耳聋的最主要的原因。其中c.919-2 A＞G突变率最高为9.86%（50/507）,其次为c.2168 A＞G，突变率为2.37%(12/507)。c.919-2 A＞G突变携带数占SLC26A4基因突变携带总数的84.75%（50/59），为广东地区SLC26A4基因的突变热点，对比李琦等（2007年）[16]的全国性调查数据可发现，广东地区热点突变频度与全国一致，c.919-2 A＞G突变的等位基因频率为6.51%，低于李琦等人的调查数据(8.46%)。此外,经过颞骨CT检查仅有2例c.919-2 A＞G杂合突变聋儿的影像学未见前庭水管扩大或内耳畸形其余57例聋儿均显示为前庭水管扩大，检出率高(96.61%，57/59)；不排除内耳影像学正常的耳聋患者与SLC26A4基因的相关性。SLC26A4基因检测结果对比颞骨CT检查结果说明SLC26A4基因突变与大前庭水管密切相关。

线粒体12S rRNA引起的遗传性耳聋属于母系遗传，与氨基糖苷类抗生素致聋相关，m.1555A＞G为主要突变方式[17-20]，国内突变携带率分别为3.8%及0.6%[21]。本研究检出m.1555A＞G均质突变8例（1.58%），检出率较低于全国普查均值，考虑可能与广东地区经济相对发达，氨基糖苷类抗生素使用量较少有关。

4 小结

本文研究的507例非综合征型耳聋患者检测结果阳性率为22.68%，其中GJB2和SLC26A4检出率占总检出率的93.04%。其中SLC 26 A4是广东地区非综合征型耳聋人群最主要的致病基因，c.919-2A＞G为该基因突变的热点；GJB2是引起广东地区非综合征型耳聋的第二位致聋基因，c.235delC为该基因突变的热点；此外，线粒体12S rRNA也可导致该地区人群的非综合征型耳聋。对广东地区常见致聋基因进行筛查，确定耳聋患者及高危人群的遗传因素，给予准确的指导及干预，可一定程度上预防耳聋的发生。

表3 c.235delC等位基因频率Table 3 Carrier frequency of c.235 del C mutation

表4 c.919-2 A＞G等位基因频率Table 4 Carrier frequency of c.919-2A＞G mutation

1 金占国.DFNA5与遗传性耳聋[J].中国听力语言康复科学杂志, 1.2011，9(3):33-36. Jin Zhanguo.DFNA5 and hereditary deafness[J].Chinese scientific Journal of Hearing and Speech Rehabilitation.1.2011，9(3):33-36.

2 Bitnerglindzicz M.Hereditary deafness and phenotyping in humans. [J].Br Med Bull,2002,63(474):73-94.

3 曲雁,王娜.Cx26、Cx30与非综合征耳聋的研究现状及基因治疗的展望[J].中华耳科学杂志,2011,09(1):106-112. Qu Yan,Wang Na.Cx26,Cx30 with the syndrome of deafness re⁃search present situation and gene therapy[J].Chinese Journal ofOtology.2011,9(1):106-112.

4 Hilgert N,Smith R C G.Forty-six genes causing nonsyndromic hear⁃ing impairment:which ones should be analyzed in DNA diagnostics? [J].Mutation Research/fundamental&Molecular Mechanisms of Mu⁃tagenesis,2009,681(2-3):189–196.

5 Wang Y C,Kung C Y,Su M C,et al.Mutations of Cx26 gene(GJB2) for prelingual deafness in Taiwan.[J].European Journal of Humange⁃netics,5.2002,10(8):495-498.

6 马静,林垦,高映勤,等.云南地区非综合征性聋患儿GJB2、SLC26A4和线粒体DNA12S rRNA基因突变分析[J].中国耳鼻咽喉头颈外科,2015,22(2):71-75. Ma Jing,Lin Ken,Gao Yingqin,et al.Analysis of the mutations in GJB2,SLC26A4 and mtDNA12S rRNA gene in children with non-syndromic hearing loss from Yunnan province[J].Chinese Jouranl of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery.2015,22 (2):71-75.

7 王剑,梁鹏飞,王淑娟,等.陕西省及周边地区非综合征性聋常见致聋基因突变频率分析[J].中国耳鼻咽喉头颈外科,2015,22(2): 67-70. Wang Jian,Liang Pengfei,Wang Shujuan,et al.Genetic analysis of non-syndromic deafness patients in Shanxi province，Gansu prov⁃ince and Ningxia Hui autonomous region[J].Chinese Jouranl of Oto⁃rhinolaryngology Head and Neck Surgery.2015,22(2):67-70.

8 戴朴,刘新,于飞,等.18个省市聋校学生非综合征性聋病分子流行病学研究(Ⅰ)--GJB2 235delC和线粒体DNA 12SrRNA A1555G突变筛查报告[J].中华耳科学杂志,2006,4(1):1-5. Dai Pu,Liu Xin,Yu Fei,et al.Molecular etiology of patients with nonsyndromic Hearing loss from deaf-mute schools in 18 provinces of China[J].Chinese Journal of Otology,2006,4(1):1-5.

9 Pu D,Fei Y,Bing H,et al.GJB2 mutation spectrum in 2063 Chi⁃nese patients with nonsyndromic hearing impairment[J].Journal of Translational Medicine,2009,7(8):1319-1320.

10 刘启珍，陈丽鸿，张应龙等.重庆市永川地区青少年耳聋患者耳聋基因热点突变筛查分析[J].中华耳科学杂志,2013,11(1): 126-130. Liu Qizhen,Chen Lihong,Zhang Yinglong,et al.Screening of Hot-Spot Deafness Gene Mutations among Adolescentswith Hearing Loss in Yong Chuan[J].Chinese journal of Otology.2013,11(1):126-130.

11 Dai P,Yu F B,Yuan Y,et al.The prevalence of the 235delC GJB2 mutation in a Chinese deaf population.[J].Genetics in Medicine, 2007,9(5):283-289.

12 戴朴,于飞,韩冰,等.中国不同地区和种族重度感音神经性聋群体热点突变的分布和频率研究[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2007,42(11):804-808. Dai Pu,Yu Fei,Han Bing,et al.Features of nationwide distribution and frequency of a common gap junction beta-2 gene mutation in China[J].Chinese Jouranl of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery.2007,42(11):804-808.

13 袁永一,黄莎莎,王国建,等.27个省市聋校学生基于SLC26A4基因IVS7-2A＞G突变的全序列分析[J].中华耳科学杂志,2011,09 (1):17-23. Yuan Yongyi,Huang Shasha,Wang Jianguo,et al.Sequencing analysis of entire SLC26A4 gene with focus on IVS7-2A＞G mutation in 2352 patients with moderate to profound SNHL in China.Chinese journal of Otology.2011,09(1):17-23.

14 Yuan Y,Guo W,Tang J,et al.Molecular Epidemiology and Function⁃al Assessment of Novel Allelic Variants of SLC26A4 in Non-Syn⁃dromic Hearing Loss Patients with Enlarged Vestibular Aqueduct in China[J].Plos One,2012,7(11):e49984-e49984.

15 戴朴,朱秀辉,袁永一,等.Pendred综合征基因热点突变筛查赤峰市聋哑学校大前庭水管综合征患者[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2006,41(7):497-500. Dai Pu,Zhu Xiuhui,Yuan Yongyi,et al.Patients suffered from en⁃larged vestibular aqueduct syndrome in Chifeng deaf and dumb school detected by Pendred’s syndrome gene hot spot mutation screening.Chinese Jouranl of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery.2006,41(7):497-500.

16 李琦,戴朴,黄德亮,等.SLC26A4基因IVS7—2A〉G突变在中国不同地区和民族重度感音聋患者中分布频率的观察[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2007,42(12):893-897. Li Qi,Dai Pu,Huang Deliang,et al.Frequency of SLC26A4 IVS7-2A＞G mutation in patients with severe to profound hearing loss from dif⁃ferent area and ethnic group In China.Chinese Jouranl of Otorhino⁃laryngology Head and Neck Surgery.2007,42(12):893-897.

17 戴朴,杨伟炎,韩东一,等.Prev-DAF试剂盒分析线粒体基因1555A-G突变[J].中华耳科学杂志,2004,2(1):37-41. DaiPu,YangWeiyan,HanDongyi,etal.MitochondrialDNA 1555A-G mutation analyzed by Prev-DAF testing kit.Chinese jour⁃nal of Otology.2004,2(1):37-41.

18 Shen Z,Jing Z,Chen B,et al.Frequency and spectrum of mitochon⁃drial 12S rRNA variants in 440 Han Chinese hearing impaired pedi⁃atric subjects from two otology clinics[J].Journal of Translational Medicine,2011,9(64):599-612.

19 Yuan Y,You Y,Huang D,et al.Comprehensive molecular etiology analysis of nonsyndromic hearing impairment from typical areas in China[J].Journal of Translational Medicine,2009,7(41):79.

20 Y-H B,C-C R,X-R G,et al.A maternal hereditary deafness pedi⁃gree of the A1555G mitochondrial mutation,causing aminoglycoside ototoxicity predisposition.[J].Journal of Laryngology&Otology, 2008,122(10):1037-1041.

21 戴朴.遗传性耳聋的预防和阻断[J].中华医学杂志,2007,87(40): 2811-2813. Dai Pu.The prevention of hereditary deafness and blocking.National Medical Journal of China.2007,87(40):2811-2813.

Epidemiological investigation of hot spot gene mutations among nonsyndromic deafness patients in Guangdong

WANG Meng,ZHOU Feng,WANG Xingjun,LIN Ying,ZHU Meichan,YU Feng
Hearing Center,Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Hospital of Guangzhou

Objective To determine the molecular causes of nonsyndromic hearing loss in Guangdong for the purposes of screening,prevention and intervention.Methods Patients with nonsyndromic hearing loss(n=507)received microarray-based testing for nine hot spot mutations in four of the most common deafness-related genes.Results The incidence of genetic errors was 22.68%(115/507).Among the patients,9.47%(48/507)showed defects in GJB2.The detection rate was 6.31%(32/507)for homozygous c.235 del C mutation,1.58%(8/507)for heterozygous mutation,0.20%(1/507)for homozygous c.299 del AT mutation,0.40%(2/507)for heterozygous mutation and 0.99%(5/507)for composite heterozygous c.235 del C/c.299 del AT mutation.Defects in SLC26A4 were seen in 11.64%(59/507)of the cases,3.16%(16/507)for homozygous c.919-2 A＞G mutation,6.11%(31/507)for heterozygous mutation,0.40%(2/507)for homozygous c.2168 A＞G mutation,1.38%(7/507)for heterozygous c.2168 A＞G mutation,and 0.59%(3/507)composite heterozygous c.919-2 A＞G/ c.2168 A＞G mutation.mtDNA 12SrRNA defects were detected in 1.58%(8/507)of the cases and all were m.1555A＞G mutation.Conclusions Our results demonstrate that SLC26A4(c.919-2A＞G)mutation is the primary genetic cause and GJB2 (c.235delC)mutation is a major genetic cause of nonsyndromic deafness in Guangdong.

Non-syndromic deafness;Genetic testing;Gene Chip

R764.43

A

1672-2922（2016）05-644-5

2015-12-30审核人：翟所强）

10.3969/j.issn.1672-2922.2016.05.018

广州市科技计划项目（2014Y2-00119）

王蒙，本科，初级技师，研究方向:听力学王蒙和周枫为并列第一作者

周枫，Email：zhoufengguangzhou@163.com