脂肪酶TL IM/K2CO3催化Markovnikov加成反应研究

杜理华，杨文俊

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)



脂肪酶TL IM/K2CO3催化Markovnikov加成反应研究

杜理华，杨文俊

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

咪唑类化合物因其具有广泛的生物活性在医药行业中占有重要的地位.实验首次采用了一种脂肪酶lipase TL IM (Thermomyceslanuginosus)/K2CO3催化的咪唑类化合物与乙烯酯类化合物的Markovnikov加成反应新方法.系统研究了催化剂lipase TL IM /K2CO3、溶剂、底物结构、底物摩尔比、温度及反应时间对Markovnikov加成反应的影响规律.实验结果表明：咪唑类化合物与乙烯酯类化合物发生Markovnikov加成反应的最佳条件为脂肪酶lipase TL IM /K2CO3(K2CO3质量分数为4.5%)，底物摩尔比1∶6，温度为50 ℃且反应时间为24 h，并在此条件下反应产率高达85%.

Markovnikov加成；咪唑类化合物；酶促反应；脂肪酶

咪唑类化合物是一类重要的杂环化合物，在天然产物、生物体、医药、农药、有机发光材料及离子液体领域都有非常重要的作用[1-7].Markovnikov加成反应是形成C—C,C—N,C—O,C—X键的重要方法之一.但用化学法催化的Markovnikov加成反应存在反应条件较苛刻、环境污染且伴有副反应发生等缺陷，影响加成反应的产率和选择性[8].因此，寻找一条高效、绿色的咪唑类化合物的Markovnikov加成反应新方法显得尤为重要.

在研究咪唑类化合物的Markovnikov加成反应过程中，文献中常用的合成咪唑类衍生物方法是利用酰化酶[9-11]、盐离子液体([bmim]BF4)[12]以及磷酸钾[13]作为催化剂来催化加成.虽然催化过程中可以得到相对较好的产率，但是酰化酶反应时间高达72 h，离子液体存在不稳定性等不足.因此，研究一种高效环保的咪唑类化合物的Markovnikov加成反应新技术成为广大化学工作者研究的热点.本实验研究了一种脂肪酶TL IM/ K2CO3催化的咪唑类化合物(4-硝基咪唑，2-甲基-4-硝基咪唑)与乙烯酯类化合物(乙酸乙烯酯，月桂酸乙烯酯，棕榈酸乙烯酯，己二酸乙烯酯)加成反应的新方法，反应时间为24h，产率最高可达85%.

1 实验部分

1.1 实验试剂

4-硝基咪唑(AR,国药集团化学试剂)，2-甲基-4-硝基咪唑(AR,国药集团化学试剂)，乙酸乙烯酯(AR，江苏永华精细化学品有限公司)，月桂酸乙烯酯(AR，东京仁成工业株式会社)，棕榈酸乙烯酯(AR，东京仁成工业株式会社)，己二酸二乙烯酯(AR，东京仁成工业株式会社)，DMSO (AR，无锡海硕生物公司)，硅胶薄板(G60，烟台江友硅胶开发有限公司)，柱层析硅胶(300～400目，烟台江友硅胶开发有限公司)， Lipozyme TL IM (Novo Nordisk)，玻璃点样毛细管(华西医科大学仪器厂)，碳酸钾(99%，分析纯，江苏彤晟试剂有限公司)，其他主要试剂都为分析纯.

1.2 实验器材

电子天平(BS224，赛多利斯科学仪器厂)，数显水浴恒温振荡器(SHA-C，金坛市江南仪器厂)，真空干燥箱(XMTD-8222，上海精宏实验设备有限公司)，三用紫外分析仪(ZF-I,上海顾村电光仪器厂)，磁力搅拌器(85-1，杭州大卫科教仪器有限公司)，旋转蒸发仪(RE-2000，上海亚荣生化仪器厂)，核磁共振仪NRM(AVANCEⅢ,瑞士Bruker公司，TMS内标)，高效液相色谱仪HPLC(依利特P230Ⅱ，大连依利特分析仪器有限公司)，傅立叶变换红外分光光度计(Avater 370，美国热电设备公司)，数字显微熔点仪(控温型，X-5，北京泰克仪器有限公司)，质谱仪(Agilent 6210 TOF，美国Agilent公司).

1.3 实验方法

将0.25 mmol咪唑类化合物(4-硝基咪唑，2-甲基-4-硝基咪唑)和1.5 mmol的乙烯酯类(乙酸乙烯酯，月桂酸乙烯酯，棕榈酸乙烯酯，己二酸二乙烯酯)完全溶解于5 mL的DMSO中，加入0.27 g TL IM 酶和0.075 mmol K2CO3(0.010 4 g)，放50 ℃恒温振荡箱中反应，转速180～200 r/min，反应过程用TLC定性监测，展开剂为V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)=3∶1.反应结束后，过滤酶并用冰水和乙酸乙酯萃取除去DMSO，减压蒸馏乙酸乙酯，经柱层析分离提纯后得到产物，再通过1H NMR，13C NMR，ESI-MS表征分析.其反应式为

2 实验结果及讨论

在研究脂肪酶TL IM/K2CO3催化的Markovnikov加成反应的过程中，为了促进加成反应的进行和抑制不必要副反应.系统地探讨了酶源、溶剂、底物摩尔比、底物的结构、温度及反应时间对咪唑类化合物的Markovnikov加成反应影响.实验研究选择以4-硝基咪唑与乙酸乙烯酯的反应为咪唑类化合物的Markovnikov加成反应的模型反应，以便于进行各种条件的优化.

2.1 催化剂中K2CO3的量对反应的影响

实验利用脂肪酶TL IM和不同摩尔的K2CO3(0，0.038，0.075，0.113，0.15 mmol)协同作用，催化4-硝基咪唑与乙酸乙烯酯的Markovnikov加成反应，实验结果如图1所示.其中，不同摩尔的K2CO3占整个催化剂质量所对应的比例分别为0%，2.3%，4.5%，6.7%，8.7%，100%.由图1中可发现：反应24 h后，在脂肪酶TL IM(K2CO3, 0 mmol)催化下，反应产率为75%，当反应完全由K2CO3催化时(脂肪酶TL IM, 0 mmol)，其产率为72%.当采用脂肪酶TL IM与K2CO3协同作用时，反应的产率可以得到明显提高.实验结果表明：当脂肪酶TL IM (K2CO3，0.075 mmol，质量分数为4.5%)情况下产率最高，可达到85%.

1—脂肪酶TL IM(0%)；2—脂肪酶TL IM与0.038 mmol K2CO3(2.3%)；3—脂肪酶TL IM与0.075 mmol K2CO3(4.5%)；4—脂肪酶TL IM与0.113 mmol K2CO3(6.7%)；5—脂肪酶TL IM与0.15 mmol K2CO3(8.7%)；6—0.075 mmol K2CO3(100%)图1 催化剂中K2CO3的含量对Markovnikov加成反应的影响Fig.1 The influence of amount of K2CO3 in catalyst on the reaction

2.2 反应溶剂对Markovnikov加成影响

对于酶催化的有机合成反应，反应介质体系是酶催化反应中重要研究内容之一.在非水酶学中，反应溶剂的物理性质(主要为疏水常数)对反应起着重要的影响.本实验我们将不同极性溶剂作为研究对象，如正己烷、吡啶、四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSO)等，其反应结果如图2所示.实验结果显示，4-硝基咪唑只有在DMF，DMSO才能够完全溶解，且在DMSO中产率最高(85%).

图2 反应溶剂对咪唑Markovnikov加成反应影响Fig.2 The influence of solvent on the reaction

2.3 底物结构对Markovnikov加成的影响

底物亲核性强弱对不同的反应(如酯化、酯交换、酰胺化和内酯化等)都有很大的影响.例如在多元醇和糖的酯化过程中都是伯羟基发生反应，在羟基和氨基存在时，水解酶显示优先催化酯化反应而不是酰化反应.所以研究底物对酶催化反应也很关键.试验将4-硝基咪唑和2-甲基-4-硝基咪唑作为Markovnikov加成的供体，乙酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、棕榈酸乙烯酯和己二酸二乙烯酯为受体，探究了底物结构对Markovnikov加成的影响.表1可以得出氮杂环上若带有吸电子基团，如硝基取代基，则有利于Markovnikov加成反应的进行，若有给电子基团如甲基，则不利于Markovnikov加成反应，且空间位阻也会影响反应的进行.从表1可以看出：4-硝基咪唑和不同乙烯酯类化合物反应，乙烯酯的链长越长，反应的活性越低，且二酸二乙烯酯的反应活性比单脂肪酸乙烯酯高.

表1 底物结构对Markovnikov加成反应的影响1)

Table 1 The influence of substrate on Markovnikov addition %

注:1) 反应溶剂为DMSO，底物摩尔比为1∶6，50 ℃，在脂肪酶TL IM/ K2CO3催化下反应24 h.

2.4 底物摩尔比对反应影响

考察了4-硝基咪唑和乙酸乙烯酯的不同摩尔比对反应产率的影响.如图3所示，当4-硝基咪唑与乙酸乙烯酯摩尔比从1∶1上升到1∶8时，底物的产率逐渐升高.底物摩尔比为1∶6时，反应产率最高，继续增加乙酸乙烯酯的量，不但没有进一步提高反应的产率，反而引起副反应的发生而影响目标产物产率，所以得出该方法的最佳底物比为1∶6.

图3 底物摩尔比对4-硝基咪唑与乙酸乙烯酯的Markovnikov加成反应影响Fig.3 The influence of substrate ratio of 4-nitroimidazole and vinyl acetate on Markovnikov addition

2.5 反应温度对Markovnikov加成反应的影响

反应温度是影响酶促反应的一大重要因素.本实验研究了40，45，50，55 ℃条件下反应的进行情况，实验结果如图4所示.研究发现产物产率随温度的升高而提高，当温度到达50 ℃时，产率最高，可达85%，此时如果继续升高反应温度，反而会引起酶活的降低，目标产物产率会降低，所以该方法的最佳反应温度为50 ℃.

图4 温度对Markovnikov加成反应的影响Fig.4 The influence of temperature on Markovnikov addition.

2.6 反应时间对咪唑Markovnikov加成反应的影响

4-硝基咪唑与乙酸乙烯酯在摩尔比为1∶6，温度为50 ℃，溶剂为DMSO，脂肪酶TL IM/K2CO3催化下的摇床中进行加成反应.不同时间的试验结果如图5所示，可以发现反应在4～12 h时产率变化很大，而16 h之后该反应慢慢趋缓，产率在24 h时达到最大(85%)，在30 h时，产物产率却为83%.因此，综合实验经济和工业生产的角度，最佳反应时间选择了24 h.

图5 反应时间对加成反应的影响Fig.5 The influence of reaction time on the Markovnikov addition

3 部分产物的表征数据

3.1 4-硝基咪唑与乙酸乙烯酯加成反应

4-硝基咪唑和乙酸乙烯酯的反应式为

乙酸1-(4-硝基咪唑基)-乙酯(1):1H NMR (500 MHz, DMSO-d6):δ=8.66 (s,1H,N=CHN),8.10(s,1H,NCH=C),6.77(q,1H,J=6.25 Hz, CH3CHO), 2.06 (s, 3H, COCH3),1.78 (d, 3H,J=6.25 Hz, CHCH3).13C NMR (125 MHz, DMSO-d6):δ=169.78 (CO), 147.80 (C4),137.24 (C2),120.13 (C5),77.34 (CH3CHO),21.13 (COCH3),20.18 (CHCH3). ESI-MS:m/z=200(M+1).

3.2 4-硝基咪唑与月桂酸乙烯酯加成反应

4-硝基咪唑和月桂酸乙烯酯的反应式为

月桂酸1-(4-硝基咪唑基)-乙酯(2):1H NMR (500 MHz, DMSO-d6):δ=8.65(s,1H,N=CHN),8.09(s,1H,NCH=C),6.80(q,1H,J=6.15 Hz, CH3CHO),2.32 (t,2H,J=7.30 Hz, COCH2CH2),1.78(d,3H,J=6.25 Hz,CH3CHO),1.48(m,2H,O=CCH2CH2),1.18(m,16H,(CH2)8CH3),0.84(t,3H,J=6.70 Hz,CH2CH3).13 C NMR(125 MHz, DMSO-d6):δ=171.78 (CO),147.40(C4),136.58(C2),119.31(C5),76.79(CH3CHO),33.25(O=CCH2),31.36(CH2CH2CH3),28.78((CH2)6CH2CH2CH3),24.13(COCH2CH2),22.04(CH2CH3),19.72(OCHCH3),13.88(CH2CH3).ESI-MS:m/z=340(M+1).

3.3 4-硝基咪唑与己二酸二乙烯酯加成反应

4-硝基咪唑和己二酸二乙烯酯的反应式为

己二酸乙烯基1-(4-硝基咪唑基)-乙酯(4):1H NMR(500 MHz, DMSO-d6):δ=8.65(s,1H,N=CHN),8.10(s,1H,NCH=C),7.20(m,1H,OCH=CH2),6.79(q,1H,J=6.19 Hz,CH3CHO),4.89,4.64(m,2H,CH=CH2),2.42～2.36(m,4H,O=CCH2),1.78(d,3H,J=6.20 Hz, CHCH3),1.53(t,4H,COCH2(CH2)2).13C NMR(125 MHz, DMSO-d6):δ=172.00,170.65(CO),147.80(C4),141.66(OCH=CH2),137.08(C2),119.94(C5),98.46(OCH=CH2),77.29(CH3CHO),33.19,33.02(COCH2CH2CH2CH2),23.76,23.70(COCH2CH2CH2CH2),20.15(CHCH3). ESI-MS:m/z=312(M+1).

3.4 2-甲基-4-硝基咪唑与乙酸乙烯酯加成反应

2-甲基-4-硝基咪唑和乙酸乙烯酯的反应式为

乙酸1-(2-甲基-4-硝基咪唑基)-乙酯(5):1H NMR (500 MHz, DMSO-d6):δ=8.63(s,1H,NCH=C),6.77(q,1H,J= 6.10 Hz, CH3CHO),2.46(s,3H,N=CCH3),2.07(s,3H,O=CCH3),1.75(d,3H,J=6.20 Hz, CHCH3).13C NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ=169.74 (CO),148.48 (C4),146.79 (C2),119.62 (C5),76.26 (CH3CHO),21.05 (COCH3),20.05 (CHCH3),13.48 (NCCH3). ESI-MS:m/z=214(M+1).

3.5 2-甲基-4-硝基咪唑与己二酸二乙烯酯加成反应

2-甲基-4-硝基咪唑和己二酸二乙烯酯的反应式为

己二酸乙烯基1-(2-甲基-4-硝基咪唑基)-乙酯(8):1H NMR (500 MHz, DMSO-d6):δ=8.62(s,1H,C=CHN),7.19(m,1H,OCH=CH2),6.69(q,1H,J=6.10 Hz,CH3CHO),4.88,4.64(m,2H,OCH=CH2),2.46(s,3H,N=CCH3),2.42～2.38(m,4H,COCH2CH2CH2CH2),1.74(d,3H,J=6.20 Hz, CHCH3),1.53-1.52 (m,4H,COCH2CH2CH2).13C NMR(125 MHz, DMSO-d6):δ=171.78,171.35(CO),147.32(C4),140.66(OCH=CH2),138.16(C2),119.64(C5),98.37(OCH=CH2),77.18(CH3CHO),33.08,32.97(COCH2CH2CH2CH2),23.66,23.57(COCH2CH2CH2CH2),20.07(CHCH3),13.26(NCCH3).ESI-MS:m/z=326(M+1).

4 结 论

本实验首次给出了一种利用脂肪酶TL IM (Thermomyceslanuginosus)/K2CO3催化的咪唑类化合物(4-硝基咪唑，2-甲基-4-硝基咪唑)和乙烯酯类化合物(乙酸乙烯酯，月桂酸乙烯酯，棕榈酸乙烯酯，己二酸二乙烯酯)的Markovnikov加成反应新方法.与已报道的方法相比，该方法首次采用经济环保的脂肪酶TL IM做催化剂，反应绿色环保且后处理简单，反应产率高.合成的8 个咪唑类衍生物分别通过柱层析分离方法得到，并且其结构均通过1H NMR，13C NMR，ESI-MS表征分析及验证.

[1] HILL R A. Marine natural products[J]. Natural product reports,2007,32(18):31-86.

[2] FORTE B, MALGESINI B, PIUTTI C, et al. ChemInform abstract: a submarine journey: the pyrrole-imidazole alkaloids[J]. Marine drugs,2009,7(4):705-53.

[3] SAMAI S, NANDI G C, SINGH P, et al. l-Proline: an efficient catalyst for the one-pot synthesis of 2,4,5-trisubstituted and 1,2,4,5-tetrasubstituted imidazoles[J]. Cheminform,2010,41(13):10155-10161.

[4] 李郁锦,夏烈,高建荣.吩嗪类化合物的绿色合成研究[J].浙江工业大学学报,2013,41(3):286-288.

[5] 赵德明，竺三奇，李敏,等，2-氯-4-硝基咪唑的合成[J],浙江工业大学学报，2011,39(5):479-483.

[6] JAYABHARATHI J, THANIKACHALAM V, PERUMAL M V, et al. Fluorescence resonance energy transfer from a bio-active imidazole derivative 2-(1-phenyl-1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthrolin-2-yl)phenol to a bioactive indoloquinolizine system[J]. Spectrochimica acta part a molecular & biomolecular spectroscopy,2011,79(1):236-244.

[7] 宋旭东,李肖华,姬登祥,等.咪唑类疏水性离子液体用于萃取苯酚的研究[J].浙江工业大学学报,2009,37(3):251-254.

[8] SMITH M B. March's advanced organic chemistry : reactions, mechanisms, and structure[J]. Molecules,2007,6(12):1064-1065.

[9] WU W B, XU J M, WU Q, et al. Promiscuous acylases-catalyzed Markovnikov addition of N-heterocycles to vinyl esters in organic media[J]. IEEE transactions on vehicular technology,2006,348(4/5):487-492.

[10] WU W B, WANG N, XU J M, et al. Penicillin G acylase catalyzed Markovnikov addition of allopurinol to vinyl ester[J]. Cheminform,2005,36(38):2348-2350.

[11] LIU B K, WU Q, LYU D S, et al. New view of acylase promiscuity: an extended study on the acylase-catalyzed Markovnikov addition[J]. Journal of molecular catalysis b: enzymatic,2011,73(1/2/3/4):85-89.

[12] XU J M, WU W B, QIAN C, et al. A novel and highly efficient protocol for Markovnikov′s addition using ionic liquid as catalytic green solvent[J]. Cheminform,2006,47(10):1555-1558.

[13] LIN S W, SUN Q, LI R T, et al. Potassium phosphate promoted aza-Markovnikov addition of N-heterocycles to vinyl esters[J]. Synthesis,2007,38(47):1933-1938.

(责任编辑：陈石平)

The Markovnikov addition catalyzed by lipase TL IM fromThermomyceslanuginosus/K2CO3

DU Lihua, YANG Wenjun

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Because of the widely biological actives, imidazole compounds play an important role in the pharmaceutical industry. The Markovnikov addition of imidazole derivatives and vinyl esters catalyzed by lipase TL IM fromThermomyceslanuginosus/K2CO3was first reported here. The influence of the amount of catalyzes, solvent, the structure of substrate, temperature and the reaction time were explored systematically. The performence of Markovnikov was better when it reacted for 24 h at 50 ℃ and was catalyzed by lipase TL IM /K2CO3(K2CO3∶TL IM /K2CO3, 4.5%, m/m) and the molar ratio of substrate was 1∶6. About 85% conversion can be finally obtained.

Markovnikov addition; imidazole compounds; enzymatic reaction; lipase

2016-03-22

国家自然科学基金资助项目(21306172)；国家948计划资助项目(2014-4-29)；浙江省自然科学基金资助项目(LY17B020010)；浙江省公益农业计划项目(2014C32094)

杜理华(1979—)，女，河南安阳人，副教授，硕士生导师，研究方向为药物合成新技术，E-mail：orgdlh@zjut.edu.cn.

R944

A

1006-4303(2016)06-0649-05