香附超临界CO2提取物体外抗肝癌作用

宋必卫，章方珺，刘洁琼，杨轶安，付再林

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)



香附超临界CO2提取物体外抗肝癌作用

宋必卫，章方珺，刘洁琼，杨轶安，付再林

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

为研究香附超临界CO2萃取物(XF)的体外抗肝癌活性，采用MTT比色法研究XF对人肝癌细胞HepG2、人正常肝细胞LO2的杀伤作用及其量-效和时-效关系；采用Annexin V-EGFP/PI双染、Rh123染色测定线粒体膜电位(Δψ)分析细胞凋亡及其机制.结果表明：XF对HepG2细胞具有强力杀伤作用，且呈明显的量-效和时-效关系.相比对肿瘤细胞和正常细胞均有较大毒性的阳性药顺铂(cis-Dichlorodiamineplatinum，DDP)，XF对LO2细胞毒性较小，相对安全.Annexin V-EGFP/PI双染结果显示XF诱导细胞凋亡.Rh 123荧光染色检测表明XF引起Δψ崩溃.表明XF具有良好的体外抗肝肿瘤作用，其机制是破坏线粒体导致内源性凋亡，值得开发成安全有效的抗肝肿瘤药.

超临界CO2萃取；香附；抗肿瘤；HepG2细胞

肿瘤严重威胁人类健康，抗肿瘤药物的研究与开发具有非常重大的意义.传统的化疗药物毒副作用大，易产生耐药性.从中草药中发现、筛选抗癌药已成为目前国内外研究的热点.

香附为莎草科植物莎草Cyperus rotundus L.的干燥根茎.有疏肝解郁，理气宽中，调经止痛功效.其药理作用广泛，具有抗炎镇痛[1]、抗抑郁[2]、降血糖[3]和抑制血小板聚集[4]等多种作用.文献报道香附醇提物有抗癌作用[5]，但未进行深入研究.本实验采用超临界CO2萃取技术对香附的有效成分进行提取，研究其对肝癌细胞HepG2的抗瘤活性和作用机制.

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 细胞株

人肝癌细胞HepG2购自南京凯基生物科技有限公司；正常人肝细胞LO2购自上海中科院细胞所.

1.1.2 试 剂

香附购自杭州中药饮片厂；DMEM高糖培养液、RPMI.1640培养液、0.25%胰蛋白酶和PBS购自吉诺生物医药技术有限公司；MTT(噻唑兰)、DMSO和Rhodamine123：SIGMA公司；澳洲胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)购自CLARK Bioscience公司；注射用顺铂(冻干型)购自齐鲁制药有限公司，批号H20023461；Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司.

1.1.3 仪 器

HA221-50-03型超临界萃取装置(南通华安超临界萃取有限公司)、生物安全柜(Nuaire，NU-425-400S)、CO2培养箱(Thermo electron corporation，NU-5510E)、倒置光学显微镜(Nikon eclipse，TS100-FDH1)、多功能酶标仪(BioTek，synergy HI)和离心机(Heraeus，LDZ5-2).

1.2方 法

1.2.1 超临界CO2流体萃取香附挥发油(以下简称XF)

将香附粉碎成粗粉，称取粉末1 000 g装入萃取釜Ⅰ(2 L)中萃取[6-7]：温度55 ℃，压强20 MPa，时间4 h.计算萃取率为

萃取率=(XF质量/原料质量)×100%

1.2.2 MTT法检测细胞活力

抑制率=(1-实验组吸光度/阴性对照组吸光度)×100%

1.2.3 Annexin V-EGFP/PI双染法检测细胞凋亡

取对数生长期的HepG2细胞[12-14]以1×104个/孔接种于24孔板，培养24 h，再分为4个组：正常对照组不做任何处理；XF组(据预实验，终质量浓度为100 μg/mL)分别在加药3，6，12 h后，小心吸弃培养液并用冷PBS清洗3 次，每孔加入500 μL Binding Buffer + 5 μL Annexin-V-EGFP+5 μL PI，室温下避光反应10 min，荧光显微镜观察、拍照.

1.2.4 细胞线粒体膜电位(Δψ)的检测

Rhodamine 123(Rh123)为膜电位敏感亲脂性阳离子荧光染料，能选择性地在活细胞线粒体内聚集，发出黄绿色荧光，其强度间接反映Δψ水平[11-12].取对数生长期HepG2细胞以5.0×103个/孔种于96孔板中，分为正常对照组、不同质量浓度XF组，每组6 个复孔.培养24 h后，弃去上清液，PBS清洗3 次，加入含10 mg/L Rh 123的无酚红DMEM培养液，37 ℃孵育30 min，移弃培养液，PBS清洗多次至背景较浅，加入适量无酚红DMEM培养液，荧光显微镜观察.多功能酶标仪检测荧光值，其中激发波长为488 nm，发射波长为530 nm.

1.2.5 统计学处理

各组实验数据均采用GraphPad Prism软件进行处理，数据用Mean±SD表示，采用One-way ANOVA检测均数差异显著性，以P<0.05为差异有显著性意义[10].

2 结 果

2.1 XF超临界CO2流体萃取

萃取得棕黄色XF为

萃取率=(10.45 g/1 000 g)×100%=1.045%

2.2 XF对细胞杀伤作用

2.2.1 一般形态学观察

如图1所示，正常对照组生长正常，细胞数量随时间延长增加.XF作用于HepG2细胞，随着时间延长和质量浓度增加，细胞数量减少，细胞皱缩变小变圆，出现凋亡特征性膜泡，部分细胞脱落悬浮，最终死亡、破碎.

图1 光镜观察不同质量浓度的XF作用24 h对HepG2形态的变化(100倍)Fig.1 Effects of different concentrations of XF on morphological changes of HepG2 cells after 24h observed by light microscope

2.2.2 XF对HepG2细胞杀伤作用的时效和量效关系

分析表1数据可知：XF在12.5～200 μg/mL范围内，均极显著降低HepG2细胞活力，且随时间延长和质量浓度增加，作用增强，呈明显的质量浓度依赖性和时间依赖性.短时间(24 h)、高质量浓度(200 μg/mL)即达峰效应(99.9%)，而DDP(4 μg/mL，短时用药作用仅达26.6%，连续使用72 h，抑制率为82.3%，远不及XF的效果(P<0.001)，而此时DDP对LO2细胞抑制高达97.9%(表2)，如此毒性是临床难以接受的.连续用药72 h，100 μg/mL的XF作用与高质量浓度DDP(4 μg/mL)相当，但对LO2抑制率仅20.2%，临床可以接受.本实验证明，XF对正常细胞毒性比DDP小，抗癌效果明显高于DDP.

表1 XF对HepG2细胞的杀伤作用的时-量-效关系(Mean±SD，n=6)

注: 1) 与正常对照组相比较，P<0.001；2) 与DDP同时间比较，P<0.001.

表2 XF作用24，48，72 h对LO2细胞的抑制率 (Mean±SD，n=6)

Table 2 Inhibition rate of XF against LO2 cells after 24, 48 and 72 h exposure(Mean±SD，n=6)

时间/hDDP/%4μg/mLXF/%100μg/mL140μg/mL200μg/mL2420．1±3．61)18．9±1．11)28．8±2．21)55．5±1．72)4853．7±1．31)8．1±2．72)30．6±4．52)94．7±2．42)7297．9±0．11)20．2±3．92)50．1±2．22)99．6±0．21)

注: 1) 与正常对照组相比较，P<0.001；2) 与DDP同时间比较，P<0.001.

2.2.3 XF对正常人肝细胞的毒性

如表2所示，XF与DDP对LO2细胞均有很强杀伤作用.但XF对LO2杀伤的质量浓度高于对肝癌细胞.考虑到：1) 抗癌治疗现状；2) 临床上肝细胞死亡50%以上时才有明显表现；3) 肝细胞再生能力强.XF在肝内质量浓度达到100～140 μg/mL(作用72 h，抑制率为20.2%～50.1%)，是可接受的选择.XF高质量浓度(200 μg/mL)作用24 h，正常肝细胞抑制55.5%，提示短期冲击疗法，值得进一步研究.

2.2.4 XF杀伤HepG2细胞和LO2细胞的IC50

XF，DDP对HepG2细胞和LO2的IC50见表3.XF对LO2有一定的毒性，但所需的剂量更大.比较XF对两种细胞的IC50值，24 h时对LO2是对HepG2的2.1 倍；72 h时对LO2是对HepG2的3.1 倍，说明XF对HepG2有较好选择性.在较低

质量浓度时，对正常细胞相对安全.而阳性对照药DDP对HepG2选择性很小(该比值24 h接近1，72 h为1.4)，安全性远差于XF.上述结果还表明：XF作用24 h即可极大杀伤癌细胞(99.9%)，对正常细胞的毒性相对小(55.5%)，提示XF可实施短期冲击治疗；而DDP需要作用72 h，此时对正常细胞毒性极大.

表3 XF和DDP对HepG2和LO2细胞的IC50

Table 3IC50of XF and DDP against HepG2 and LO2 cells

时间/hDDP/(μg·mL-1)HepG2LO2XF/(μg·mL-1)HepG2LO22411．1813．982．14170．8482．662．7960．94152．0721．151．6343．44133．2

2.3 XF诱导HepG2细胞凋亡

如图2(原图为彩色，经灰度转变为图2，外圈暗灰色为原图的细胞膜绿染，中间亮灰色为原图的细胞核红染)所示，正常对照组的细胞中有极少量暗灰色(极少量细胞膜绿染)；XF作用3 h后有少量暗灰色(少量细胞膜绿染)，显示细胞凋亡早期的特征；6 h后部分细胞已呈外圈暗灰，中间亮灰色(部分细胞双染)，细胞固缩但保持形态完整，提示部分细胞处于凋亡中晚期；12 h后细胞内的亮灰色更亮，提示大多细胞都进入了凋亡中晚期.本结果证明：1) 诱导细胞凋亡是XF抗癌的主要作用机制；2) 作用迅速.

图2 Annexin V-EGFP/PI双重荧光染色(HepG2细胞，200 倍)Fig.2 Fluorescence images of Annexin V-EGFP/PI double staining(HepG2 cells)

2.4 XF致HepG2细胞线粒体膜电位(Δψ)崩溃

图3(原图为绿色荧光图，经灰度转变为图3)表示XF作用HepG2细胞24 h后Δψ崩溃，且随着质量浓度的升高而加剧，呈一定的剂量依赖性.本结果表明：损伤线粒体、激活内源性凋亡通路而导致HepG2细胞凋亡是XF抗癌的主要作用机制.图3(e)中：与正常对照组相比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.

图3 XF致HepG2细胞线粒体Δψ崩溃(Rh 123标记法)Fig.3 Inhibitory effect of XF on Δψ dissipation of HepG2 cells (labeled with Rh123 and detected by fluorescence microscope)

3 结 论

多数抗肿瘤药物在杀死癌细胞的同时也对正常细胞产生严重毒性.筛选肿瘤药物时，要求能选择性毒杀肿瘤细胞而对正常细胞毒性小.本实验采用超临界CO2萃取技术对分离提取XF.预实验表明：XF比醇提物抗癌活性更高，为更好地发挥XF抗癌作用提供了工艺路线.实验发现XF对HepG2细胞具有选择性杀伤作用，且随药物质量浓度和作用时间的增加而增强，呈现明显的量-效和时-效关系.而临床广泛使用、疗效确切的DDP对癌瘤细胞的选择性差，故认为XF比顺铂更安全.Annexin V-EGFP/PI双染及膜电位(Δψ)检测结果证明XF损伤线粒体而诱导细胞凋亡是其抗癌作用主要机制.以上结果表明：XF具有高效体外抗肿瘤作用，相对安全，值得进一步研究开发成有自主知识产权的抗肿瘤新药.

致谢：本文中超临界CO2萃取部分工作得到药学院钱俊青教授和郭辉副教授无私帮助和精心指导，谨致感谢！

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(责任编辑：陈石平)

Study on the anti hepatoma activity of cyperus rotundus by supercritical CO2fluid extraction in vitro

SONG Biwei, ZHANG Fangjun, LIU Jieqiong, YANG Yian, FU Zailin

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

This study was performed to investigate anti hepatoma activity of the effective component of rhizoma cyperi with the technique of supercritical CO2fluid extraction (XF) in vitro. The cytotoxicity of XF both on human hepatoma cells HepG2 and on normal human hepatocytes LO2 were evaluated by MTT assay. Annexin V-EGFP/PI double staining and Rhodamine123 (Rh123) staining were tested in the preliminary study of its mechanism. Results: XF showed a significant dose dependent and time dependent cytotoxicity to the tumor cells. Compared to the positive control drug cisplatin (DDP), which has a great toxicity on both tumor and normal cells, XF is less toxic to LO2 cells. Annexin V-EGFP/PI double staining showed that XF could strongly induce apoptosis. Rh123 method indicated that XF caused the loss of mitochondrial membrane potential. In Conclusion: XF has a remarkable anti hepatoma effect in vitro and is expected to be developed into an effective anti hepatoma drug.

supercritical CO2extraction; rhizoma cyperi; anti-tumor; HepG2 cell

2016-03-23

宋必卫(1956—)，男，安徽岳西人，教授，研究方向为神经分子药理学，E-mail: bwsong@zjut.edu.cn.

R965

A

1006-4303(2016)06-0645-04