猪融合抗菌肽基因双质粒共转化重组毕赤酵母菌的构建

陈 骞，万小平，肖永乐，唐健雪，赵世纪，高 荣

（四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室，四川 成都 610064）

猪融合抗菌肽基因双质粒共转化重组毕赤酵母菌的构建

陈 骞，万小平，肖永乐，唐健雪，赵世纪，高 荣*

（四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室，四川 成都 610064）

为构建高效表达的猪融合抗菌肽蛋白的重组酵母菌发酵表达体系，规模化生产制备新型免疫分子防控动物传染病，本试验从实验室先前构建的pGAPZαA-P质粒中克隆出已构建好的猪融合抗菌肽CAMPs基因片段。通过Infusion技术，将CAMPs片段分别克隆入pPIC9K和pPICZαA真核表达质粒中，并通过PCR以及测序验证，成功构建了pPIC9K-CAMPs和pPICZαA-CAMPs重组质粒。通过电转化将线性化pPIC9K-CAMPs转入毕赤酵母GS115基因组中，并筛选高拷贝菌株GS-PK-CAMPs。再将线性化pPICZαA-CAMPs转入重组酵母GS-PK-CAMPs中，筛选出高拷贝菌株GS-PKZ-CAMPs。对重组酵母GS-PKZ-CAMPs进行诱导表达后作转录表达研究，检测抗菌肽是否表达。最终结果显示，成功获得了GS-PKZ-CAMPs可诱导表达菌株，这给猪融合抗菌肽蛋白的大规模发酵制备和应用于动物传染病的防治奠定了可靠的初步基础。

猪抗菌肽；融合基因；共表达；双质粒转化；毕赤酵母

抗菌肽作为宿主防御肽，是机体天然的免疫保护屏障，不但具有良好的抗菌活性，还具有很强的稳定性与安全性[1]，因具有独特的抗菌机制，微生物对其产生耐药性的概率极低[2]。国内外的研究结果表明，抗菌肽不但能够显著提高动物的抗病能力，有的还能促进动物生长[3]。因此，抗菌肽作为新型抗感染分子制剂来替代抗生素，具有极大的应用价值。本研究通过Infusion方法将实验室已构建好的猪融合抗菌肽基因分别插入pPIC9K和pPICZαA质粒，再将双重组质粒电转入毕赤酵母GS115中，并进行高拷贝菌株的筛选，对其进行初步的基因表达发酵研究，为今后高效生产制备抗菌肽奠定初步基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 宿主菌、载体质粒 毕赤酵母GS115及其表达载体pPIC9K、pPICZαA，购买自Invitrogen公司，大肠杆菌DH5α为本实验室保存，重组质粒pGAPZαAP为本实验室构建，含猪融合抗菌肽基因。

1.2 表达载体的构建 根据已构建好的基因片段和载体酶切位点信息设计2对Infusion引物，保证CAMPs基因的PCR产物与载体有15 bp的同源序列：

（1）CAMPs-KF：5忆-GCTGAAGCTTACGTAGAAT TCATGAGAAGTGTGAAAA-3忆；

CAMPs-KR：5忆-AAGGCGAATTAATTCGCGG CCGCTTTAAATAGCGGCCGCCTAA-3忆；

（2）CAMPs-ZF：5忆-AGAGAGGCTGAAGCTGAAT TCATGAGAAGTGTGAAAACCAGCAAG-3忆；

CAMPs-ZR：5忆-TGTTCTAGAAAGCTGGCGGCCG CCTAATGGTGATGGTGATGATGCTT-3忆。

以pGAPZαA-P为模板，使用以上2对引物克隆出CAMPs-K和CAMPs-Z基因片段。使用EcoR I和Not I双酶切载体pPIC9K和pPICZαA。使用Infusion技术，将CAMPs-K插入pPIC9K质粒中，将CAMPs-Z插入pPICZαA质粒中。最终获得重组质粒pPIC9KCAMPs和 pPICZαA-CAMPs，使用特异性引物（CAMPs-KF和CAMPs-KR、CAMPs-ZF和CAMPs-ZR）以及通用引物（5忆AOX1、3忆AOX1）进行PCR验证。将验证后的重组质粒再经测序验证正确后转入大肠杆菌DH5α中。

1.3 重组酵母GS-PK-CAMPs的构建 使用质粒大提试剂盒大量提取重组质粒pPIC9K-CAMPs，并使用Sal I将构建好的重组质粒pPIC9K-CAMPs线性化。参照毕赤酵母表达操作手册，制作毕赤酵母GS115感受态细胞。将获得的线性化质粒pPIC9K-CAMPs电转化入制备好的毕赤酵母GS115感受态中，电转化条件为：电压1.5kV，电容25μF，电阻200Ω，电击时间为10ms。待电转化完成后，将转化后的酵母细胞均匀涂布于MD平板中，30℃恒温培养至转化子出现。将转化子挑选出置于含G418浓度梯度的YPD培养基中，进行高拷贝菌株的筛选。挑选耐G418浓度最高的菌株，命名为GS-PK-CAMPs。

1.4 重组酵母GS-PKZ-CAMPs的构建 使用质粒大提试剂盒大量提取重组质粒pPICZαA-CAMPs，并用Sac I将其线性化。后将线性化载体电转入筛选出的GS-PK-CAMPs感受态中，感受态的制备及电转化条件同1.3。涂布于含Zeocin浓度梯度及G418浓度为2.0mg/mL的YPD培养基中，进行高拷贝菌株的筛选。挑选耐Zeocin浓度最高的菌株，命名为GS-PKZCAMPs。使用酵母基因组提取试剂盒提取GS-PKCAMPs酵母基因组，使用CAMPs-KF和CAMPs-KR两对引物对其进行CAMPs基因的扩增，验证CAMPs基因是否成功插入酵母基因组中。

1.5 重组酵母GS-PKZ-CAMPs的基因表达分析 将1.4中构建的GS-PKZ-CAMPs通过BMGY扩大培养，其培养条件为：30℃，220r/min，培养24h至OD为2～6，然后3 200 r/min，5 min离心，收集菌体，转移至BMMY培养基诱导发酵表达，甲醇浓度为0.5%，30℃，220r/min诱导发酵24h后收集酵母菌体。使用Trizol混合细胞菌体后，用氯仿提取，离心后取上清，再用异戊醇提取，离心后取沉淀，经乙醇漂洗，用DEPC水溶解RNA沉淀。使用TIANGEN公司的第一链反转录试剂盒，反转录得到重组毕赤酵母GS-PK-CAMPs总RNA的cDNA文库。使用CAMPs-KF和CAMPs-KR两对引物对其进行CAMPs基因的扩增，验证CAMPs的表达情况。

2 结果与分析

2.1 表达载体的构建 CAMPs-K的目的基因片段大小为1 660 bp，CAMPs-Z的目的基因片段大小为1672bp，二者以pGAPZαA-P为模板的PCR扩增产物电泳图如图1所示，PCR条带大小约为1700 bp，与预期一致，证明CAMPs基因被成功克隆。图2为重组质粒pPIC9K-CAMPs和pPICZαA-CAMPs的PCR扩增电泳图谱。通用引物的PCR结果显示：两个质粒在2100bp左右均有明显条带，与预期结果一致，证明CAMPs基因已被成功插入两个载体。值得注意的是，通用引物的PCR在1000～1500bp处存在一条带，经Prime Premier软件分析，为5忆AOX1引物在CAMPs片段距5忆端511bp处配对，与3忆AOX1引物形成一条长度为1158bp的PCR产物。最终，结果经过测序验证，插入序列正确。将二者成功转入大肠杆菌，方便后续大量提取质粒。

图1CAMPs基因PCR扩增产物电泳图（1%琼脂糖凝胶）

图2pPIC9K-CAMPs和pPICZαA-CAMPs重组质粒的PCR扩增产物电泳图（1%琼脂糖凝胶）

图3GS-PK-CAMPs高拷贝菌株的筛选（G418浓度梯度，mg/mL）

2.2 重组酵母GS-PK-CAMPs的构建 通过大提质粒试剂盒，获得了浓度为1.27 μg/μL的重组质粒pPIC9K-CAMPs，经线性化后电转入毕赤酵母GS115感受态，然后涂于MD培养基中，3d后出现了许多转化子，将转化子用少量YPD培养基稀释后涂于含G418浓度梯度的YPD平板上，3d后的生长状态如图3所示。最后成功筛选到了抗G418浓度为2.0mg/mL的菌株，并命名为GS-PK-CAMPs。

2.3 重组酵母GS-PKZ-CAMPs的构建 通过大提质粒试剂盒，获得了浓度为1.12μg/μL的重组质粒pPICZαA-CAMPs，经线性化后电转入GS-PK-CAMPs感受态中，涂于含G418和Zeocin浓度梯度的MD平板中，3d后的生长情况如图4所示。最后成功筛选到了抗Zeocin浓度为150μg/mL的菌株，并命名为GSPKZ-CAMPs。

图4GS-PKZ-CAMPs高拷贝菌株的筛选（Zeocin浓度梯度，μg/mL）

2.4 重组酵母GS-PKZ-CAMPs的基因表达分析 重组酵母GS-PKZ-CAMPs经过甲醇诱导表达后，提取其总RNA反转录成cDNA，经PCR扩增后（电泳条带见图5）结果显示：GS-PKZ-CAMPs转录组cDNA文库PCR产物在2 000 bp左右存在明显条带，同时1 000 bp左右的条带也符合重组质粒的通用引物PCR结果，证明转录组中存在有CAMPs基因，即CAMPs基因已被成功表达。

图5GS-PKZ-CAMPscDNA文库通用引物PCR扩增产物电泳图（1%琼脂糖凝胶）

3 讨论

本试验成功从实验室已有的材料中提取出了CAMPs基因片段，并且通过Infusion技术成功将其插入pPIC9K和pPICZαA质粒中，获得了重组质粒pPIC9K-CAMPs和pPICZαA-CAMPs。为了获得大量的猪融合抗菌肽蛋白以供后续研究甚至产业化使用，我们通过设计毕赤酵母pPIC9K和pPICZαA双质粒转化系统，在体内增加猪融合抗菌肽基因拷贝量，从而在一定程度上增加了其蛋白表达量。

该系统结合了抗性筛选和双质粒转化两个步骤：从抗性筛选方面讨论，pPIC9K质粒中含有的kana抗性在同源重组进入酵母基因组后会赋予酵母遗传霉素抗性，参照Invitrogen公司的pPIC9K质粒产品说明，单拷贝的kana抗性基因能够赋予毕赤酵母约0.25 mg/mL的遗传霉素抗性，由于 kana基因与pPIC9K质粒的表达盒之间存在遗传连锁效应，故而可从酵母对遗传霉素的抗性水平来筛选高拷贝量的重组子。同时，类似的遗传连锁效应对于pPICZαA和Zeocin也适用。

pPIC9K质粒经过Sal I线性化后，能够重组入毕赤酵母 GS115基因组的 his4基因位点中，而pPICZαA质粒经Sac I线性化后，则能重组进入毕赤酵母GS115基因组的AOX1基因位点中。双质粒转化的优势在于，后转化的pPICZαA质粒可以同源重组插入pPIC9K的5忆AOX1中。从而达到增加猪融合抗菌肽基因的拷贝数的目的[4]。

本试验成功将构建的两个重组表达质粒依次转化入毕赤酵母GS115中，通过转录表达分析，确定猪融合抗菌肽基因能够正确表达，对于大量表达猪融合抗菌肽蛋白有着重要意义。同时，抗菌肽融合蛋白可诱导表达体系建立，给猪融合抗菌肽蛋白的大规模发酵制备和应用于动物传染病的防治奠定了可靠的初步基础。

[1]Andreu D，Rivas L.Animal antimicrobial peptides: an overview[J].Biopolymers，1999，47（6）：415-433.

[2]陈福，罗玉萍，龚熹，等.抗菌肽耐药性研究进展[J].微生物学通报，2008，35（11）：1786-1790.

[3]Bals R，Wang X，Meegalla R L，et al.Mouse β-defensin 3 is an inducible antimicrobial peptide expressed in the epithelia of multiple organs[J].Infection and Immunity，1999，67（7）：3542-3547.

[4]王慧，窦文芳，张晓梅，等.应用双质粒共表达体系提高融合蛋白GGH在毕赤酵母GS115中的表达量[J].生物工程学报，2011，27（7）：983-989.

Construction of Recombinant Pichia Pastoris Transformed With Dual Plasmids for Fusion Genes of Porcine Antimicrobial Peptides

CHEN Qian，WAN Xiaoping，XIAO Yongle，et al.
（Life Science College of Sichuan University，Key Laboratory for Bio-Resource and Eco-Environment of Ministry Education，Key Laboratory for Animal Disease Prevention and Food Safety of Sichuan Province，Sichuan Chengdu 610064，China）

In order to construct high effective expression recombinant yeast to produce economically novel fusion porcine antimicrobial peptide in large scale for the control of animal diseases，the experiment was conducted to clone the fusion CAMPs genes from the recombinant pGAPZαA-P vector constructed early in our laboratory.Then the two fusion genes were respectively inserted into expression plasmid pPIC9K and pPICZαA by Infusion cloning technology.The recombinant plasmids，named as pPIC9K-CAMPs and pPICZα-A-CAMPs，were successfully constructed and confirmed by PCR and sequencing analysis.After that，the linearized pPIC9K-CAMPs was inserted into pichia pastoris GS115 by electroporation，and screened for highcopy strain named as GS-PK-CAMPs.Then linearized pPICZαA-CAMPs was inserted into recombinant yeast GS-PK-CAMPs and screened for high-copy strain named as GS-PKZ-CAMPs.Next，induced fermentation of GS-PKZ-CAMPs was carried out to detect the expression of CAMPs gene.The final result showed that the recombinant pichia GS-PKZ-CAMPs strains with dual plasmids transformation was successfully obtained，which lay the reliable basis for future production of fusion antimicrobial peptides to promote the control level of animal infectious diseases.

Porcine antimicrobial peptides；Fusion gene；Co-expression；Dual plasmids transformation；Pichia pastoris

S818.9

B

1001-8964（2016）12-0028-04

2016-06-20

陈 骞（1990-），男，广西资源县人，硕士研究生，研究方向：兽用抗菌肽相关研究和真核表达体系的构建。

*通讯作者：高 荣（1966-），男，四川西昌人，博士，教授，博士生导师，研究方向：动物免疫学、动物传染病和微生物学、基因工程学等。