晚期自发性高血压大鼠肝肾阴虚证候特征评价

吴智春，于华芸，季旭明，欧阳兵

山东中医药大学，山东 济南 250355

晚期自发性高血压大鼠肝肾阴虚证候特征评价

吴智春，于华芸，季旭明，欧阳兵

山东中医药大学，山东 济南 250355

目的 观察晚期自发性高血压大鼠（SHR）的证候特征。方法 取12月龄健康雄性SHR大鼠10只设为证候组（SHR组），同龄雄性Wistar-Kyoto大鼠10只设为对照组（WKY组）。采用大鼠辨证方法学，将四诊信息转化为具有同等意义的一般行为学指标，观察实验大鼠午后肛温、舌色、抓力、学习记忆能力、血清雌二醇（E2）和睾酮（T）水平等，并进行比较分析。结果 与WKY组比较，SHR组大鼠午后肛温较高，舌色偏红，前爪抓握能力及肌力较差，学习记忆能力减退，血清T水平偏低，E2/T比值较高，基本符合肝肾阴虚证的表现。结论 晚期SHR具有肝肾阴虚证候特征。

病证结合；动物模型；肝肾阴虚；自发性高血压大鼠

自发性高血压大鼠（spontaneously hypertension rat，SHR）具有稳定的高血压遗传性，与人类高血压的病程演变相似，其症状、体征及生化指标等随周龄增长而变化[1]，在不同的发展阶段其中医证候特征也是稳定均一的[2]，通过观察其病理特征、症状和体征等探讨其中医证候特征，有助于建立符合中医特征的病证结合动物模型。本实验采用大鼠辨证方法学，通过代以定量或半定量的同等意义观察方法和测试指标，将四诊信息转化为一般的行为学指标，对晚期SHR进行辨证分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

SPF级雄性12月龄Wistar-Kyoto大鼠（WKY大鼠，体质量410～470 g）和SHR（体质量340～370 g）各10只，北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2006-0009。WKY大鼠作为SHR同种系正常对照组（WKY组），SHR设为证候组（SHR组）。

1.2 主要试剂与仪器

雌二醇（E2）、睾酮（T）罗氏配套试剂。MD3000型大鼠血压心率测定仪，淮北正华科技有限公司；MC-142L型电子体温计，欧姆龙大连有限公司；电子秤，北京六一仪器厂；YP600型电子天平，上海精科天平仪器厂；E601型全自动电化学发光分析仪，瑞士罗氏公司。

1.3 一般状况观察和测定

观察大鼠活动、毛发色泽，测定饮水量、大小便、体质量等；测量安静、清醒状态下大鼠尾动脉收缩压，取连续3次平均值，16:00时开始测量肛温。

1.4 舌色观察分析

参照文献[3]将麻醉大鼠置于暗室，用数码相机摄取舌象。摄像时采用统一固定的内光源，大鼠舌及数码相机放置位置及摄影角度均固定。应用Image Pro Plus 6.0医学图像分析系统提取每只大鼠舌象的舌尖、舌中、舌根3部分的Density red、Density green、Density blue值，并分别取平均值（Density mean）后进行分析。

1.5 抓力测定

网屏为50 cm×40 cm网带，网眼为l cm×l cm，网板左右和上方均用25 cm高木板框边，网屏距地面高度为80 cm，下方铺以12 cm厚海绵。先将网屏水平放置，将大鼠放置其上，然后缓缓地将其一端抬高，在2 s内将此网屏变成垂直位，保持5 s，观察大鼠是否会从网屏上下来或用前爪抓握住网屏，从而评价前爪抓握能力及肌力情况。评分标准分为4个等级。0分：前爪握住网屏达5 s，不会掉落；1分：暂时握住网屏，滑落一段距离，但未掉落；2分：在5 s内掉落；3分：网屏转动即刻掉落。

1.6 Morris水迷宫定位航行实验

采用Morris水迷宫定位航行实验对大鼠空间学习记忆能力进行评估。Morris水迷宫装置参照文献[4]，选用大鼠通用型圆桶，水池直径120 cm，在圆桶上缘设等距东、西、南、北4个标记点，将水面和水桶分成4个象限。实验时水桶加水至37 cm，水温控制在23～25 ℃，水内添加墨汁，使其呈黑色不透明状。先将大鼠放入水池中进行自由游泳训练2 min，使其熟悉环境。每日于固定时间段，每个时间段训练4次历时5 d。实验时将高度为35 cm、直径为8 cm的平台设置于东北象限，将大鼠首先由远离平台的西南象限入水[5]，然后分别由其他3个象限入水，至其找到平台，记录其找到平台的时间（逃避潜伏期），并在台上停留2 min。如果120 s未能找到，则将其放在平台上2 min，潜伏期记录为120 s。每日以大鼠4次训练潜伏期平均值作为大鼠当日学习成绩。

1.7 血清雌二醇、睾酮检测

10％水合氯醛0.35 mL/100 g大鼠腹腔注射麻醉，腹腔静脉取血，分离血清，电化学发光法检测血清E2和T，计算E2/T比值。

1.8 统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，组间比较采用t检验，等级资料采用秩和检验；Morris水迷宫定位航行实验潜伏期数据采用重复测量数据的方差分析[6-7]，若不满足球对称假设，则用Greenhouse-Geisser方法进行校正，若分组因素和时间因素存在交互效应，则进一步做单独效应分析；在单独效应分析中，同一时间点上2组间进行t检验或t'检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状况比较

与WKY组比较，SHR组大鼠毛发蓬乱，色发黄而无光泽，脱落较多，爪肉垫瘦削、色红少光泽，尿色偏黄，粪便颗粒较小、质地较干；与WKY组比较，SHR组大鼠血压升高、肛温偏高、体质量降低（P＜0.01）。结果见表1。

表1 2组大鼠血压、肛温和体质量比较（±s）

表1 2组大鼠血压、肛温和体质量比较（±s）

注：与WKY组比较，**P＜0.01

组别只数 血压/mm Hg 肛温/℃ 体质量/g WKY组10 136.50±11.38 34.21±0.79 440.94±29.47 SHR组10 222.47±20.64**35.19±0.51**353.69±15.23**

2.2 舌色比较

SHR组大鼠舌象Density red值显著高于WKY组大鼠（P＜0.05），Density mean、Density green和Density blue值组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。表明SHR组大鼠舌色较WKY组偏红。

表2 2组大鼠舌色分析比较（±s）

表2 2组大鼠舌色分析比较（±s）

注：与WKY组比较，*P＜0.05

组别只数Density mean Density red Density green Density blue WKY组10 86.6±7.2 117.4±10.4 70.5±6.5 71.9±7.0 SHR组10 93.4±8.7 128.5±13.0*75.7±6.6 75.9±7.4

2.3 抓力比较

WKY组和SHR组大鼠网屏训练评分比较差异有统计学意义（P＜0.01），SHR组评分较高，见表3。表明SHR大鼠的前爪抓握能力及肌力较差。

表3 2组大鼠网屏训练评分比较（只）

2.4 空间学习记忆能力测评

首先通过球对称检验判断重复测量数据之间是否存在相关性。检验结果显示P＝0.027，不满足球对称假设，说明5次重复测量数据间存在高度相关性。之后分析采用Greenhouse-Geisser方法进行校正。结果表明，不同时间潜伏期差异有统计学意义（F＝11.359，P＜0.01），WKY组和SHR组F值分别为251.542和217.253（P＜0.01）；WKY组和SHR组逃避潜伏期均随时间降低（F＝7.219，P＜0.05）。时间和分组交互作用差异无统计学意义（F＝1.152，P＞0.05），表明时间因素的作用不随分组的不同而不同。从各时间点看，第3日和第4日，SHR组逃避潜伏期较WKY组长（P＜0.05），见表4。综合分析各项结果表明SHR大鼠学习记忆能力减退。

表4 2组大鼠不同时间点逃避潜伏期比较（±s，s）

表4 2组大鼠不同时间点逃避潜伏期比较（±s，s）

注：a表示时间主效应的F值、P值；b表示组别主效应的F值、P值；c表示时间和组别之间交互效应的F值、P值

组别 只数 第1日 第2日 第3日 第4日 第5日 Sum F值 P值WKY组 10 30.6±10.1 17.8±12.1 11.9±7.6 11.6±4.2 10.8±3.5 16.5±10.9 251.542 0.000 SHR组 10 29.2±15.9 24.2±9.4 21.1±8.2*19.6±9.9*12.6±2.1 21.3±11.2 217.253 0.000 Sum 29.9±13.0 21.0±10.9 16.5±9.0 15.6±8.5 11.7±2.9 11.359a0.000at值/F值 0.235 -1.328 -2.600 -2.344 -1.411 7.219b1.152c0.334cP值 0.817 0.201 0.018 0.031 0.175 0.015b

2.5 血清雌二醇、睾酮检测结果

SHR组大鼠血清T浓度低于WKY组（P＜0.01），E2/T比值高于WKY组（P＜0.05），组间比较血清E2浓度差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表5。

表5 2组大鼠血清E2和T浓度比较（±s）

表5 2组大鼠血清E2和T浓度比较（±s）

注：与WKY组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 只数 E2/（pmol/L） T/（nmol/L） E2/T WKY组 10 96.42±20.95 6.89±2.77 16.25± 8.08 SHR组 10 94.60±19.06 3.91±1.38**27.78±12.31*

3 讨论

SHR与人类高血压的发病最为相似，是目前研究原发性高血压最为理想的动物模型，可分为3个时期：高血压前期（5～7周龄）、早期（4～7月龄）、晚期（12～14月龄）。有学者认为，SHR存在证候的自然发生和演变[8]，不同发展阶段有不同的症状和体征，通过辨证可表现为不同的证型，从而建立最大可能模拟中医临床实际、且符合临床病理生理过程的高血压病证结合动物模型。

高血压病属中医“眩晕”“头痛”等范畴。其中医病因病机较为复杂，在不同病期有着不同的证候表现。初起病位在肝，实证为主，多见肝阳偏亢、肝火上炎；病程迁延日久，及至中晚期，影响心、肾，则多见虚证。对高血压证型统计分析研究，发现高血压的主体特点是以肝阳上亢或肝肾阴虚为基本特点[9]，在其病变过程中，证型表现有从明显的肝阳上亢证向肝肾阴虚转化的趋势[10]。临床资料亦显示，高血压患者有青壮年时期以肝火上炎、肝阳上亢为主，中老年时期以肝肾阴虚为主的表现[11]。

结合高血压病中医病因病机及证候演变规律，本研究显示，晚期SHR可能以肝肾阴虚为多见。我们前期文献研究发现，腰膝酸软、脉弦细、阴虚发热、舌红少苔、健忘为高血压病肝肾阴虚证的核心症状[12]。本研究采用与SHR源自同一种群且不具备高血压特征的WKY大鼠为对照，以网屏实验评分表现大鼠抓握能力，反映腰膝酸软；以午后肛温观察是否有阴虚发热表现；以Morris水迷宫定位航行实验逃避潜伏期评价记忆能力；应用Image pro plus医学图像分析系统软件，客观观察和分析大鼠舌色，对晚期SHR大鼠的中医证候特征进行研究分析。

实验结果显示，与同龄WKY大鼠比较，SHR血压较高，高血压病诊断明确。此外发现SHR毛发蓬乱、发黄而无光泽、脱落较多，尿液颜色偏黄，粪便颗粒较小、质地较干，爪肉垫瘦削色红少光泽。提示晚期SHR有较明显的肾虚和火热烁津的表现。SHR大鼠午后肛温高于WKY组，舌象Density red显著高于WKY组大鼠，提示可能存在阴虚发热和舌红的表现。网屏训练结果显示，SHR组评分显著高于WKY组，说明SHR前爪抓握能力及肌力较差，提示可能存在腰膝酸软症状。Morris水迷宫定位航行实验结果显示，WKY组和SHR组5 d逃避潜伏期比较差异有统计学意义，SHR组逃避潜伏期较长，表明SHR学习记忆能力减退，提示出现健忘症状。

肝肾阴虚证病理组织学基础研究表明，内分泌腺机能紊乱是肝肾阴虚过程中的一个重要环节，血清T和E2水平有助于指导原发性高血压的中医临床辨证分型和治疗，亦有临床研究显示，肝肾阴虚型高血压患者血液T和E2浓度降低，可能与肝肾阴虚者阴液不足有关[13]。为进一步了解晚期SHR肝肾阴虚证候特点，本研究还检测了实验大鼠血清E2和T水平。结果发现，SHR组血清T浓度低于WKY组，E2/T高于WKY组，组间比较血清E2浓度无明显差异。这可作为对晚期SHR肝肾阴虚证型特点的有效补充。

综上，晚期SHR有阴虚发热、腰膝酸软、健忘和舌红等肝肾阴虚证的典型表现，其中医证候特征可初步辨识为肝肾阴虚证。

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Evaluation of the Characteristics of Liver-kidney Yin Deficiency Syndrome in Late Stage of

Spontaneously Hypertension Rats

WU Zhi-chun, YU Hua-yun, JI Xu-ming, OUYANG Bing (Shandong

University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

Objective To observe the characteristics of liver-kidney yin deficiency syndrome in late stage of spontaneously hypertension rats (SHRs). Methods Ten 12-month-old healthy male SHRs were put into syndrome observer group (SHR group), while ten male WKY rats with the same age were set as control group (WKY group). Syndrome differentiation method on rats was employed to transform the four-diagnostic information into general behavior indexes with the same significance. The afternoon anal temperature, tongue color, holding power, ability of learning and memory, serum estradiol and testosterone level were observed, compared and analyzed. Results Compared with the WKY group, rats in the SHR group had higher afternoon anal temperature, redder tongues, poorer strength and claw holding power and their ability of learning and memory was retarded; the level of serum estradiol was lower; the ratio of estradiol to testosterone was higher. All of these were largely in line with deficiency of live-kidney yin syndrome. Conclusion SHRs in late stage show characteristics of liver-kidney yin deficiency syndrome.

combination of disease and syndrome; animal model; liver-kidney yin deficiency; SHRs

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.016

R228

A

1005-5304(2016)03-0058-04

中国博士后科学基金面上项目（2011M501162）；山东省高等学校科技计划项目（J11LF07）

欧阳兵，E-mail：doctoroy@126.com

（2015-05-29）

（2015-07-21；编辑：华强）