自发性高血压大鼠心肌组织Sirt3表达的增龄性变化

郝广华，韩振华，靳耀锋，袁海峰，董新

(西安交通大学医学院第二附属医院 1.心内科，2.病理科，3.脑病科，陕西 西安 710004)



·论 著·

自发性高血压大鼠心肌组织Sirt3表达的增龄性变化

郝广华1，韩振华1，靳耀锋2，袁海峰3，董新1

(西安交通大学医学院第二附属医院 1.心内科，2.病理科，3.脑病科，陕西 西安 710004)

目的：探讨自发性高血压(SH)大鼠心肌组织沉默信息调节因子3(Sirt3)表达的增龄性变化。方法：将36只不同周龄Wistar- Kyoto(WKY)大鼠和SH大鼠分为WKY 16、32、64周3个周龄组和SH 16、32、64周3个周龄组，每组6只。采用尾套测压法测量各组大鼠尾动脉收缩压，采用Masson染色观察心肌纤维化，免疫组化染色及免疫组织印迹法检测左心室心肌组织Sirt3的表达。结果：与同周龄WKY大鼠相比，SH大鼠血压显著升高(P<0.05)，心肌组织胶原纤维组织明显增多，Sirt3蛋白表达水平均显著下降(均P<0.05)，且呈增龄性下降趋势。结论：SH大鼠肥厚的心肌组织sirt3表达呈增龄性下降。

高血压； 心肌肥厚； 心室重构； 沉默信息调节因子3； 大鼠

高血压心室重构是指在血流动力学负荷以及神经体液因素等的长期作用下心脏的结构及功能发生变化。早期的心室重构是一种对抗心室壁张力增加的适应性代偿反应；后期是心力衰竭发生、发展的基础，与心律失常、猝死以及心力衰竭的发生密切相关，因此是心脏事件的独立危险因素[1]。

沉默信息调节因子3(silent information regulator protein 3， sirturin 3，Sirt3)属于Ⅲ类组蛋白脱乙酰基酶类，利用NAD+作为底物，使乙酰化蛋白的赖氨酸去乙酰化，从而参与调节多种生理及病理过程，如寿命、细胞生存、细胞周期、能量代谢、基因组稳定性、脂肪酸合成、糖及胰岛素代谢[2]。本实验以自发性高血压(spontaneously hypertensive，SH) 大鼠为研究对象，观察高血压重塑的左心室心肌组织中Sirt3的表达情况，探讨高血压心室重构过程的新机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 动物 36只不同周龄(16、32、64周)SH大鼠和Wistar- Kyoto(WKY)大鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[许可证号:SCXK(沪)2007- 0005]。将动物分为不同周龄(16、32、64周)WKY和SH组，每组6只。动物饲养于室温23 ℃左右、12 h明暗交替的环境中，允许自由饮食。所有实验操作已得到西安交通大学医学院动物伦理委员会批准。

1.1.2 试剂 兔抗Sirt3多克隆抗体以及生物素化山羊抗兔IgG购自美国Santa Cruz公司，免疫组化试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司，DAB显色剂购自北京中山生物技术公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠血压测量 采用尾套测压法测量各组大鼠尾动脉收缩压(SBP)。方法如下：上午9：00点左右，在安静环境下将清醒状态大鼠置于37 ℃温箱内约15 min；调整测压仪内温度达37 ℃后，将大鼠放到小笼内，血压测量仪的压脉套固定大鼠尾部近心端；调整大鼠鼠尾和换能器接触的部位，调节仪器的感知，定大鼠血压域值。待大鼠安静时用冲气球加压，快达到域值时缓慢放气，速度3～4 mmHg·s-1，将感知钮调到灵敏位置，此时仪器开始测压，最后长鸣一声标志测压结束，记录此时的血压值。测量3次，取平均值作为所测的血压。

1.2.2 组织标本制备 各组大鼠称重并测压，经水合氯醛0.35 mg·kg-1腹腔麻醉后打开胸腔，迅速分离并取出心脏，投入预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)中，洗净残血并去除大血管、心房及右心室，左心室称重后沿垂直于心脏长轴方向分为两部分：一部分放入4%多聚甲醛液固定，石蜡包埋；另一部分分为数块投入液氮中保存，用于组织总蛋白的提取。

1.2.3 Masson染色 4%多聚甲醛固定液固定组织，石蜡包埋切片，厚度为5 μm，常规脱蜡至水，置Masson复合染液中8 min，0.2%醋酸水溶液清洗2次，再置入1%磷钨酸中15 min，0.2%醋酸水洗2次，至亮绿染液40 s，0.2%醋酸水溶液清洗2次，滴度酒精脱水；二甲苯透明，中性树胶封片。倒置显微镜下观察，胶原纤维呈绿色，心肌纤维呈红色。

1.2.4 免疫组化染色 组织切片常规脱蜡，0.01 mmol·L-1的柠檬酸盐抗原修复液(pH 6.0)抗原热修复，正常山羊血清抗体封闭后加入兔抗大鼠Sirt3多克隆抗体(1∶400)，4 ℃过夜后DAB显色剂显色，苏木素复染、脱水、透明、封片。实验中用PBS替代一抗作为阴性对照。

1.2.5 免疫印迹检测 用裂解液(RIPA)裂解组织后提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白含量。稀释蛋白样品为10 μg·μ l-1，加入上样缓冲液后煮沸10 min后离心，进行8%SDS- PAGE凝胶电泳并电转至PVDF膜上，封闭缓冲液封闭1 h后滴加兔抗大鼠 Sirt3抗体(稀释倍数1∶200)，4 ℃孵育过夜，山羊抗兔IgG孵育45 min，TBST洗膜，置于化学发光试剂中反应1～3 min；常规方法显影定影，采用Gel Doc 2000系统拍照及行灰度分析。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠血压情况

如图1所示：与同周龄WKY大鼠比较，SH大鼠收缩压显著增加(P<0.05)，并且随周龄增加而呈增加趋势；WKY组大鼠收缩压的增龄性变化则不明显。

2.2 各组大鼠心肌组织胶原含量变化

Masson染色可见SH大鼠心肌细胞肥大，心肌间质及血管旁的胶原纤维组织明显增多，排列紊乱，且随周龄增加，SH大鼠的胶原染色明显增加。WYK大鼠心肌间隙清晰可见，胶原纤维分布稀疏，着色淡，胶原纤维染色在不同WKY周龄组间变化不明显。见图2。

2.3 各组大鼠心肌组织Sirt3蛋白表达

免疫组化染色结果表明，Sirt3免疫染色阳性表达主要分布于心肌细胞细胞浆中(图3)。与同周龄WKY大鼠相比，SH大鼠Sirt3蛋白表达水平显著降低。且随周龄增加，SH大鼠Sirt3表达呈明显下降趋势。WKY大鼠心肌细胞Sirt3表达亦呈下降趋势，但不如SH大鼠的变化明显(图3)。

a 与同周龄WKY大鼠相比，P<0.05

图1 各组大鼠SBP

Fig 1 SBP in SH and WKY rats

进一步采用免疫印迹实验方法观察各组大鼠左心室心肌组织中Sirt3蛋白的表达水平。如图4所示，SH大鼠心肌组织中Sirt3蛋白的表达显著低于同周龄WKY大鼠(P<0.05)。与WKY大鼠相比，SH大鼠Sirt3蛋白表达呈明显增龄性减低趋势。

3 讨 论

高血压是最常见的心血管慢性疾病之一，近些年发病率呈明显增高趋势。流行病学调查显示，老年性高血压患者半数以上以收缩压增高为主，且易出现心力衰竭、动脉粥样硬化、脑卒中等严重的心脑血管并发症[3]。高血压伴发的心室重构可导致心肌细胞坏死、纤维化，心室扩张，最终发生心力衰竭及心律失常[4]。本实验证实随着SH大鼠周龄的增加，血压增高，同时心肌细胞肥大，心肌间质胶原纤维组织明显增多。

图2 各组大鼠胶原染色 普通光镜×200

Fig 2 Left ventricular collagen fiber of rats evaluated by Masson staining(×200)

Sirtuin属于NAD+依赖的蛋白去乙酰化酶，参与调节代谢、应激反应以及衰老过程[2]。其中Sirt3是线粒体内存在的关键去乙酰化酶。Sirt3在心脏中大量表达，可拮抗心肌肥厚的发生[5]。在本实验中，随着SH大鼠血压的升高以及心肌肥厚的发生，Sirt3的表达显著下降。提示Sirt3表达下调参与了高血压心室重构的病理过程。既往研究显示，Sirt3-/-小鼠更易发生心肌肥厚，而Sirt3过表达阻止了心肌肥厚的发生，其机制可能是Sirt3阻断了心肌肥厚时Ras的活化，并进一步阻断MAPK/ERK以及PI3K/Akt通路[6]。心肌肥厚的另一个信号通路是氧化应激以及活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生。Sirt3可部分阻断促心肌肥厚因子引起的ROS产生，这一机制主要通过调控Foxo3a及其下游因子，如超氧化物歧化酶SOD、SOD2的线粒体亚型以及过氧化氢酶的表达及活性[6]。此外，也可能存在其他一些机制参与Sirt3的抗心肌肥厚作用,如Sirt3可介导LKB1去乙酰化，随后激活AMPK，进而阻断心肌肥厚发生[7]。

图3 各组大鼠Sirt3蛋白免疫组化染色 普通光镜×200

Fig 3 Immunohistochemcal staining of Sirt3 in left ventricle of rats(×200 magnification)

a 与同周龄WKY大鼠相比，P<0.05

图4 免疫印迹法显示各组大鼠左心室Sirt3蛋白的表达

Fig 4 Sirt3 protein levels in left ventricle of rats analyzed by Western blotting analysis

除外心肌肥厚，Sirt3与衰老性疾病也有关。临床试验发现，与青年人相比，以静态生活方式为主的60岁以上人群，其肌肉组织中Sirt3水平下降约40%，采用耐力锻炼后，其Sirt3水平上升[8]。本实验证实，WKY大鼠随周龄增加，Sirt3亦呈下降趋势，提示Sirt3表达不足可能参与了机体衰老的发生。线粒体电子传递过程中产生的ROS可破坏线粒体外的大分子结构，这一过程参与了许多与衰老有关的病理过程。Sirt3可部分拮抗此作用。Sirt3通过转录后水平调节SOD2，继而参与调控细胞内ROS的水平[9]。此外，Sirt3也可通过直接作用或去乙酰化线粒体内电子转移链的一些组分，如复合物Ⅰ和Ⅲ，直接调控细胞内ROS产生[10- 11]。有实验证实，Sirt使mPTP开放的调节因子CypD去乙酰化，抑制其活性，减少通过mPTP的促凋亡因子流入细胞以及细胞内ATP的耗竭，从而有望成为治疗与衰老有关心脏疾病的新手段[12]。

总之,本实验证实了SH大鼠心室重构发展过程中存在Sirt3表达下调现象，此结果将有助于揭示高血压心室重构发生发展的新机制，并为高血压心室重构的干预提供可能的靶点。

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Expression changes of Sirt3 with age in the left ventricle of spontaneously hypertensive rats

HAO Guang- hua1，HAN Zhen- hua1，JIN Yao- feng2，YUAN Hai- feng3，DONG Xin1

(1.Department of Cardiology，2.Department of Pathology，3.Department of Encephalopathy，the SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversitySchoolofMedicine，Xi’an710004，China)

Objective： To investigate the expression changes of Sirt3 with age in left ventricle of spontaneously hypertensive(SH) rats. Methods: Thirty- six Wistar- Kyoto(WKY) and SH rats of different age were divided into WKY (16，32，64 weeks) and SHR(16， 32， 64 weeks)groups with 6 rats in each group. Systolic blood pressure of rats was measured by tail cuff method and left ventricular fibrosis was detected by Masson staining. The level of Sirt3 expression was analyzed by immunohistochemistry staining and Western blotting. Results: In comparison with WKY rats of the same age， the systolic blood pressure(P<0.05) and left ventricular fibrosis of rats in SH rats were higher. The expression of Sirt3 protein was lower in the SH rat group and was decreased with age(P<0.05).Conclusion: Sirt3 expression in the hypertrophic left ventricle of SH rats is decreased with age.

hypertension； hypertrophy； cardiac remodeling； silent information regulator protein 3; rats

2016- 03- 28

2016- 04- 13

国家自然科学基金资助项目(30900693)；陕西省社会发展科技攻关项目(2015SF021)

郝广华(1978-)，女，陕西宝鸡人，主治医师，医学博士。E- mail:guanghua- h@163.com

韩振华 E- mail：drhanzhenhua029@163.com

郝广华，韩振华，靳耀锋，等.自发性高血压大鼠心肌组织Sirt3表达的增龄性变化[J].东南大学学报：医学版，2016，35(4)：487- 491．

R- 33; R544.1

A

1671- 6264(2016)04- 0487- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.04.003