Slug与食管癌侵袭转移间的关系及其调控机制研究

魏娉，路三军，严金海，郭俊萍，姜琳娜

(1.邯郸市第一医院，河北 邯郸 056002； 2.磁县人民医院，河北 邯郸 056500)



·论 著·

Slug与食管癌侵袭转移间的关系及其调控机制研究

魏娉1，路三军1，严金海2，郭俊萍1，姜琳娜1

(1.邯郸市第一医院，河北 邯郸 056002； 2.磁县人民医院，河北 邯郸 056500)

目的:研究Slug与食管癌侵袭转移间的关系及其调控机制。方法:分别将构建好的pcDNA 3.1- Slug和miR- 140通过Lip 2000转染到Eca- 109中，以pcDNA 3.1和Lip 2000空转作为对照组，显微镜下观察转染前后细胞的形态变化，检测细胞中E- 钙黏素、N- 钙黏蛋白和波形蛋白的表达情况变化，另外使用穿透小室法检测细胞的侵袭能力在转染前后的变化情况。结果:转染pcDNA 3.1- Slug和miR- 140到Eca- 109中后细胞变得细长。转染pcDNA 3.1- Slug的Eca- 109中E- 钙黏素表达下调，N- 钙黏蛋白和波形蛋白表达上调，细胞穿透基质胶的数量明显增多。转染miR- 140的Eca- 109中E- 钙黏素表达上调，N- 钙黏蛋白和波形蛋白表达下调，细胞穿透基质胶的数量明显减少。在食管癌细胞中miR- 140和Slug的表达呈负相关(r=-0.96)。结论:转录因子Slug能够提高食管癌上皮细胞的间质转化能力和侵袭能力，而miR- 140是通过调控Slug来调节食管癌细胞侵袭性的。

Slug； 微小核糖核酸- 140； 食管癌； 侵袭能力； 上皮细胞- 间充质转化

在上皮细胞- 间充质转化(EMT)发生过程中，E- 钙黏素、N- 钙黏蛋白和波形蛋白等多种信号分子参与其中，在该过程中发挥着重要作用[1- 4]。Slug基因是一种锌指转录因子，研究显示，其在EMT的发生和发展过程中具有非常重要的作用，肿瘤的血管生成和转移与Slug基因的表达密切相关[5- 7]。另外研究显示，miRNA在EMT中也具有非常重要的作用，例如miR- 200和miR- 205均已被证明能够一直EMT，从而降低癌细胞的侵袭能力[8- 9]。然而miR- 140可能与Slug在食管癌侵袭和转移的过程中具有某种相互作用。本研究探讨了二者在食管癌侵袭和转移过程中的关联，以期为后期食管癌转移的控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

Eca- 109人食管癌细胞株购自上海天呈医流科技股份有限公司,Slug cDNA的全长pcDNA 3.1载体由作者所在实验室研究人员构建完成,氯仿购自上海一基生物试剂有限公司,PCR试剂盒购自上海生工生物技术有限公司,Liposomes转染试剂盒购自Invitrogen公司,RPMI 1640购自Hyclone公司,相关引物由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 pc- DNA3.1- Slug载体构建 设计Slug的引物序列为上游：5′- GCTCCTTCCTGGTCAAGAAACAT- 3′，下游：5′- CCGAGGTGAGGATCTCTGGTT- 3′。使用氯仿抽取Eca- 109细胞总RNA后反转成cDNA，再使用Slug的引物扩增Slug DNA片段，然后构建重组pcDNA 3.1- Slug质粒并测序鉴定。测序鉴定无误后使用Lip 2000将构建好的重组pcDNA 3.1- Slug质粒和miR- 140分别转染至Eca- 109中，标记为pcDNA 3.1- Slug/Eca- 109组和miR- 140/Eca- 109组，另以Lip 2000转染Eca- 109细胞和pcDNA 3.1质粒转染组作为对照组。

1.2.2 细胞形态学观察 转染48 h后在显微镜下观察各组细胞形态学变化。

1.2.3 免疫化学检测细胞中E- 钙黏素、N- 钙黏蛋白和波形蛋白的表达 将转染的细胞培养48 h后浆细胞接种在涂有多聚赖氨酸的盖玻片上，细胞贴壁后取出拨片，用之前已预冷的丙酮固定，PBS冲洗，加入对应的1∶1 000稀释过的一抗，30 min后PBS冲洗5 min，重复3次，然后加入二抗，37 ℃ 30 min后PBS冲洗5 min，重复3次，再加入三抗，30 min后PBS冲洗5 min，重复3次，然后DBA显色。计算E- 钙黏素、N- 钙黏蛋白和波形蛋白呈阳性的细胞数。

1.2.4 实时PCR检测miR- 140和Slug的表达情况 引物设计：miR- 140茎环引物序列为：正义链5′- GGCAGAGAGTCCTAGCAGTC- 3′，反义链5′- AGTCAGATGACAGCCCCACA- 3′，Slug茎环引物序列为正义链5′- GCATTTCTTCACTCCGAAGC- 3′，反义链5′- TGAATTCCATGCTCTTGCAG- 3′。

表达量的计算公式为：相对表达量(R)=2-△△ct=

2-[(ct样品- ct内参)- (ct空白- ct内参空白)]。

1.2.5 穿透小室法检测细胞体外侵袭能力 将穿透小室置于24孔板内，微孔膜嵌套上室铺一层基质胶，嵌套下室加入500μl事先配好的RPMI 1640(含有10%胎牛血清)，然后在嵌套上室中加入200 μl细胞悬液，每小组设置3复孔，培养48 h后取出小室，去基质胶后使用4%的多聚甲醛固定，HE染色后显微镜下观察细胞并计数，穿膜的细胞数表示肿瘤细胞的侵袭能力。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 转染前后细胞的形态变化

转染培养24 h后在光镜下观察细胞的形态学变化可知，pcDNA 3.1- Slug/ Eca- 109及miR- 140/Eca- 109组细胞与Lip 2000/Eca- 109组细胞及pcDNA 3.1/Eca- 109组细胞在形态学上的区别主要是pcDNA 3.1- Slug/Eca- 109及miR- 140/Eca- 109转染的细胞更细长，见图1A、B、C。

A.未转染； B.pcDNA 3.1- Slug/Eca- 109转染，细胞变得更细长； C.miR- 140/Eca- 109转染

图1 转染培养24 h后光镜下观察图 ×400

2.2 体外验证miR- 140对EMT转化的调控作用

免疫化学染色显示，E- 钙黏素主要位于Eca- 109细胞的胞浆和胞膜中，N- 钙黏蛋白主要位于包膜中，波形蛋白主要位于胞浆中，呈颗粒状。蛋白质印迹法检验NC(non- specific control)、miR- 140模拟物、inhibitor加NC以及inhibitor转染Eca- 109细胞后E- 钙黏素、N- 钙黏蛋白、波形蛋白的表达情况，结果显示，miR- 140表达上调，相应的E- 钙黏素表达量上升，N- 钙黏蛋白和波形蛋白表达量下降。反之，在miR- 140表达受到抑制时，E- 钙黏素表达量下降，N- 钙黏蛋白和波形蛋白表达量上升。据此可以推测miR- 140的表达可能调控E- 钙黏素、N- 钙黏蛋白和波形蛋白的表达。见图2、3。

GAPDH为甘油三磷酸脱氢酶

图2 miR- 140表达对EMT标志物表达影响的蛋白质印迹法检测结果

图3 miR- 140表达对EMT标志物表达影响的积分光密度(IOD)检测结果

2.3 miR- 140对Slug的调控作用

为检测miR- 140对Slug的调控作用，使用免疫印迹法检测miR- 140的表达量变化与Slug表达量之间的关系。结果显示，miR- 140的表达与Slug的表达呈负相关(r=-0.96)，该结果预示着miR- 140很有可能是通过作用于Slug基因来发挥调控作用的。见图4～7。

2.4 miR- 140通过Slug发挥作用的验证

为验证miR- 140在Eca- 109细胞中对Slug的调控作用，通过RNA干扰的方法检测miR- 140的表达与Slug表达的关系，结果显示，Slug的表达水平在miR- 140抑制剂和siRNA/对照组共转染细胞中均明显降低。穿透小室侵袭实验结果显示，与对照组相比，miR-140抑制剂转染沉默Slug的细胞后细胞的浸润力发生了一定程度的逆转。由此说明，miR- 140可能需要通过Slug发挥作用。见图8、9。

图4 定量实时检测食管癌组织和对应癌旁组织中Slug相对于GAPDH的表达水平

图5 实时检测NC组、miR- 140模拟物、抑制剂加NC和miR- 140抑制剂的Eca- 109细胞中Slug的mRNA表达水平

图6 蛋白质印迹法检测NC组、miR- 140模拟物、抑制剂加NC和miR- 140抑制剂的Eca- 109细胞中的Slug表达水平(以GAPDH作为对照)

图7 miR- 140与Slug的mRNA在肿瘤样本中表达量之间的关系

3 讨 论

近年来食管癌在全球范围内的致死率已经上升至第6位[10- 11]。临床上主要采用手术并辅以放疗和化疗的治疗方法，然而肿瘤易转移而使患者的生存率始终保持在很低的水平[12]。阐明食管癌发生的机制对其预防和治疗具有非常重要的意义。癌细胞的侵袭性主要是通过极性和黏附性来体现的，一旦有极性和黏附性的上皮细胞被转化成具有侵袭性和移动性的间充质细胞后癌细胞便变成了具有侵袭性的细胞[13]。EMT因在上皮细胞恶性肿瘤的发生和发展过程中具有重要作用而成为研究的热点之一[14]。研究显示，九成以上的恶性肿瘤均发生EMT而成为具有浸润性的细胞而发生转移[15]。Slug是转录因子Snail家族的一员，主要编码一种锌指蛋白，在胚胎发育过程中发挥着重要的作用，也是激活EMT过程中非常重要的转录因子之一[13]。其在EMT发生过程中主要有E- 钙黏素、N- 钙黏蛋白和波形蛋白等标志物表达量的改变，主要是在具有浸润性的细胞中E- 钙黏素表达下调、N- 钙黏蛋白和波形蛋白表达上调。研究表明，miRNA在EMT的发生过程中也发挥着调控作用，通过RNA干扰机制来沉默肿瘤基因[16]。有研究显示，miR- 140在EC细胞中的表达量下降，Slug的表达量在EC细胞中却有所增加，但是其机制并未阐明。本研究旨在阐述Slug与食管癌侵袭转移间的关系并阐明其调控机制。

本研究结果显示，将pcDNA 3.1- Slug质粒和miR- 140转入Eca- 109细胞中构建稳转株，同时以miR- 140的模拟物、miR- 140抑制剂等来调控miR- 140的表达量，以此来探讨miR- 140的表达量和Slug表达量及其他标志物表达量之间的关系。研究结果显示，沉默miR- 140导致E- 钙黏素表达量的减少、N- 钙黏蛋白和波形蛋白的表达量上升，能穿过基底膜的细胞数量明显增加，显示具有侵袭性和转移性的细胞数量明显增多。而在miR- 140高表达的样本中，由于miR- 140表达量的上升而导致E- 钙黏素表达量上升，能穿过基底膜的细胞数量明显减少，说明具有侵袭性和转移性的细胞数量明显减少，N- 钙黏蛋白和波形蛋白表达量的下降，且miR- 140表达量和Slug的表达量呈负相关，其相关系数为-0.96。推测原因miR- 140对Slug的调控可能是与其3′- UTR结合而发挥作用，具体机制还有待进一步研究。

aP<0.05

A. 在Eca- 109细胞中Slug的相对表达量，可以看出抑制剂+siRNA/对照组和抑制制剂组的Slug相对表达量明显高于抑制剂+siRNA/Slug组；B.不同组别中侵袭细胞数目，可以看出抑制剂+siRNA/对照组和抑制剂组侵袭细胞百分含量明显高于抑制剂+siRNA/Slug组

图8 Slug在miR- 140抑制剂和siRNA/对照组共转染以及Slug沉默的细胞中的表达

图9 穿透小室实验检测结果 ×100

综上所述，在食管癌细胞中Slug高表达从而能诱导EMT的发生，增强癌细胞的侵袭和转移能力，而miR- 140的过表达能够增强Eca- 109细胞的侵袭和转移能力，且miR- 140是通过靶向调控Slug的表达来影响食管癌的侵袭力和转移的。

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Relationship between Slug and the invasion and metastasis of esophageal carcinoma and its regulation mechanism

WEI Ping1，LU San- jun1，YAN Jin- hai2，GUO Jun- ping1，JIANG Lin- na1

(1.The First Hospital of Handan City，Handan 056002，China； 2.The People’s HospitalofCixian，Handan056500，China)

Objective： To study the association of Slug with invasion and metastasis of esophageal carcinoma and its regulating mechanism. Methods: pcDNA 3.1- Slug recombinant plasmid was constructed and transfected into esophageal carcinoma cell lines of Eca- 109，with pcDNA 3.1 and Lip 2000 mock transfection served as control group. The morphological changes of cells were observed under the microscope. The expressions of E- cadherin， N- cadherin and vimentin were determined， and invasion ability of the cells before and after transfection was detected by Transwell chamber method. Results:The cells of miR- 140/Eca- 109 and pcDNA 3.1- Slug/Eca- 109 became elongated. The expression of E- cadherin was down- regulated，and N- cadherin and waveform protein was increased in the Eca- 109 cells when transfected with pcDNA 3.1- Slug.The expression of E- cadherin was up- regulated， and N- cadherin and waveform protein was decreased in the Eca- 109 cells when transfected with miR- 140.The number of cells through the Matrigel was significantly reduced. The expression of miR- 140 and Slug in esophageal carcinoma cells was negatively correlated(r=-0.96). Conclusion: The Slug transcription factor can improve the ability of mesenchymal transition and invasion of esophageal epithelial cells， and miR- 140 may regulate the cell invasion of Eca- 109 via controlling Slug expression．

Slug; miR- 140; esophageal cancer; invasion ability; epithelial- mesenchymal transition

2016- 02- 01

2016- 03- 20

魏娉(1974-)，女，河北邯郸人，副主任医师，医学硕士。E- mail:2049167585@qq.com

魏娉，路三军，严金海，等.Slug与食管癌侵袭转移间的关系及其调控机制研究[J].东南大学学报：医学版，2016，35(4)：569- 574．

R735.1

A

1671- 6264(2016)04- 0569- 06

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.04.022