临床相关剂量参附注射液预处理对肠缺血再灌注致急性肺损伤的影响

刘志刚，付湘云，刘永芳，胡 刚，谢恒涛

武汉大学人民医院麻醉科，湖北 武汉 430060

临床相关剂量参附注射液预处理对肠缺血再灌注致急性肺损伤的影响

刘志刚，付湘云，刘永芳，胡 刚，谢恒涛

武汉大学人民医院麻醉科，湖北 武汉 430060

目的:探讨临床相关等效剂量参附注射液(SFI)预处理对大鼠肠缺血再灌注致急性肺损伤的影响。方法:建立肠缺血再灌注致急性肺损伤模型。健康大鼠40只随机分成5组，每组8只。对照组(C组):肠系膜上动脉仅分离而不阻断；损伤组(I/R组):肠系膜上动脉阻断1小时后再灌注2小时，股静脉给予等量生理盐水进行对照；参附注射液预处理组(SFPR组):肠系膜上动脉阻断前1小时将10 m L/kg的参附注射液从股静脉恒速泵入；血晶素组(H em i n组):肠系膜上动脉阻断前24小时腹腔注射H em i n 75 μm ol/kg。锌原卟啉IX+SFPR组(ZnPPIX+SFPR组):肠系膜上动脉阻断前24小时腹腔注射锌原卟啉IX(20 m g/kg),后续操作同SFPR组。术前无需给药的各组腹腔注射等剂量的生理盐水，于再灌注2小时后颈动脉放血处死动物。观察肺组织中血红素加氧酶1(H O-1)的表达，丙二醛、过氧化物歧化酶(SO D)含量和肺通透性指数、动脉血气和湿重比值的影响。结果:与I/R组比较，SFPR组和H ei m组肺组织H O-1细胞阳性表达增高；ZnPPIX+SFPR组上述阳性细胞表达降低(P＜0.05)。SFPR组和H ei m组肺通透性指数、肺组织M D A含量和湿/干重比均显著降低，SO D值明显升高(P＜0.05)；与C组比较，I/R组肺通透性指数与肺组织M D A含量和湿/干重比明显增高，而SO D含量显著降低(P＜0.05)；各组动物动脉血PaO2、PaCO2较C组显著下降(P＜0.05)，SFPR组和H ei m组PaO2、PaCO2明显高于I/R组。结论:临床相关剂量的参附注射液预处理能明显减轻肠缺血再灌注导致的急性肺损伤，其机制与上调H O-1蛋白表达、一定程度上抑制脂质过氧化、拮抗氧自由基的损伤有关。

再灌注损伤；肺脏；肠黏膜；血红素加氧酶-1；参附注射液

胃肠道参与休克及多器官功能不全综合征(MODS)的病理生理过程中，肠缺血再灌注期间胃肠道及远隔脏器损伤的保护是临床多学科研究的热点。其中以急性肺损伤引起的急性呼吸窘迫综合症尤为突出。参附注射液(Shenfu injection，SFI)已应用于休克和多器官功能不全综合征的防治，尤其是胃肠道和肺损伤的保护。近年研究发现参附注射液可改善油酸所致的急性呼吸窘迫综合征ARDS的血流动力学、肺及血液的氧合功能，对肺损伤具有一定的保护和治疗作用［1-3］。本研究探讨临床相关等效剂量参附注射液预处理对肠缺血再灌注损伤所致的急性肺损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂 参附注射液(吉林卓怡康纳制药有限公司生产，批号:050301)；氯化高铁血红素(Sigma公司生产，批号:20131021)；兔抗人HO-1多克隆抗体(武汉博士德生物工程公司生产，批号:BA0602)，免疫组化SABC(批号:060203)、SOD (批号:050809)、MDA试剂盒(批号:050208)(均由santa cruz公司生产)。

1.2 动物分组及造模 健康雄性Wistar大鼠40只，体质量200～260 g，由武汉大学医学院实验动物中心提供。随机分成5组(n=8)，对照组(C组)、缺血再灌注组(I/R组)、参附注射液预处理组(SFPR组)、血晶素组(Hemin组)、锌原卟啉IX+ SFPR组，实验前12小时禁食，自由饮水。称重，10%水合氯醛4 mg/kg腹腔麻醉后固定。参照Koji Ito等［4］的方法复制肠I/R模型，对照组(C组):肠系膜上动脉仅分离而不阻断；损伤组(I/R组):肠系膜上动脉阻断1小时后再灌注2小时，股静脉给予等量生理盐水进行对照；参附注射液预处理组(SFPR组):肠系膜上动脉阻断前1小时将10 mL/kg的参附注射液从股静脉恒速泵入；血晶素组(Hemin组):肠系膜上动脉阻断前24小时腹腔注射Hemin75 μmol/kg。锌原卟啉IX+SFPR组(ZnPPIX+SFPR组):肠系膜上动脉阻断前24小时腹腔注射锌原卟啉IX(20 mg/kg)，后续操作同SFPR组。术前无需给药的各组腹腔注射等剂量的生理盐水，于再灌注2小时后颈动脉放血处死动物。

1.3 方法

1.3.1 SA BC免疫组化方法检测H O-1蛋白表达 免疫组化染色程序:采用免疫组化染色，以肺组织切片细胞胞浆中出现棕黄色颗粒状沉淀物为阳性细胞。采用HIPAS-2000型全自动图像分析系统，对HO-1的蛋白表达进行半定量分析，在显微镜下对阳性染色进行分析，测定HO-1平均吸光度(OD)，随机测定5个高倍视野后计算其平均值。

1.3.2 血气分析测定 大鼠处死前右颈动脉采血1 mL抗凝行血气分析。按要求将血液填充到与i-STAT血气分析仪配套的血气分析测试片加样池中，避免气泡产生，将测试片插入自动血气分析仪，读取PaO2和PaCO2数值。

1.3.3 肺通透性指数测定 支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白浓度与血清中蛋白浓度之比，即为肺通透性指数，指数增大说明肺毛细血管通透性增加，它是评价肺损伤的指标［5］。

采用考马斯亮蓝蛋白测定法测支气管肺泡灌洗液中蛋白含量。

1.3.4 肺组织M D A、SO D含量测定 取右肺中叶100 mg(湿重)，以硫代巴比妥酸法测MDA，以黄嘌呤氧化酶法测SOD。1.3.5 分析天平测量肺组织湿/干重比(w et w ei ght t o dry w ei ght rat i o，W/D) 取左肺部分组织，滤纸吸干表面附着水分，用分析天平准确测量湿重并记录，于80℃恒温箱烤24小时至肺干重恒定，称干重，计算W/D。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行分析，实验数据以(s)表示，采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 参附注射液对肺组织H O-1表达的影响 与C组比较，I/R组、SFPR组和Heim组肺组织HO-1细胞阳性表达增高；与I/R组比较，SFPR组和Heim组肺组织 HO-1细胞阳性表达增高；ZnPPIX+SFPR组上述阳性细胞表达降低(P＜0.05)。I/R组肺通透性指数与肺组织MDA含量明显高于C组，而SOD含量显著降低(P＜0.05)；与I/R组比较，SFPR组和Heim组肺通透性指数、肺组织MDA含量均显著降低，SOD值明显升高 (P＜0.05)，ZnPPIX+SFPR组与I/R组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 参附注射液对肺组织H O-1(O D)和M D A、SO D含量表达的影响(s)

表1 参附注射液对肺组织H O-1(O D)和M D A、SO D含量表达的影响(s)

注:*表示与C组比较，P＜0.05；#表示与I/R组比较，P＜0.05。

组别 只数 H O-1(O D) M D A/(nm ol·m L-1) SO D(N U·m L-1) C组 8 0.111±0.016 3.77±0.57 112.81±20.25 I/R组 8 0.167±0.015*6.46±0.73*50.78±16.74*SFPR组 8 0.194±0.017*#4.62±0.39*#85.47±8.51*#H em i n组 8 0.209±0.013*#4.46±0.42*#94.09±13.71*#ZnPPIX+SFPR组 8 0.114±0.018#6.70±0.46 52.33±15.26

2.2 参附注射液对大鼠肺组织湿/干重比的影响 与C组相比，I/R组肺组织湿/干重比增高50%(P＜0.05)，SFPR组和Heim组较I/R组分别降低17.4%和18.6%(P＜0.05)，但仍高于C组 (P＜0.05)；ZnPPIX+SFPR组与I/R组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 参附注射液对肺通透性指数和肺组织湿/干重比的影响(s)

表2 参附注射液对肺通透性指数和肺组织湿/干重比的影响(s)

注:*表示与C组比较，P＜0.05；#表示与I/R组比较，P＜0.05。

2.3 参附注射液对动脉血气的影响 各组动物动脉血pH值相近，无显著统计学意义。大鼠缺血再灌注后，PaO2、PaCO2较C组显著下降(P＜0.05)。SFPR组和Heim组PaO2、PaCO2明显高于I/R组，ZnPPIX+SFPR组与I/R组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表3 各组大鼠动脉血气分析比较(s)

表3 各组大鼠动脉血气分析比较(s)

注:*表示与C组比较，P＜0.05；#表示与I/R组比较，P＜0.05。

组别 只数 pH PaO2/m m H g PaCO2/m m H g C组 8 7.41±0.05 100.00±0.90 37.50±3.50 I/R组 8 7.47±0.06 80.20±4.10*28.60±2.30*SFPR组 8 7.44±0.04 94.80±3.40#33.30±4.00#H em i n组 8 7.45±0.05 93.50±3.90#35.70±5.30#ZnPPIX+SFPR组 8 7.46±0.03 81.10±2.00 30.20±4.10

3 讨论

肠缺血/再灌注损伤是一种临床上很常见的临床现象，研究表明，肠缺血再灌注损伤不仅会加重肠道损伤，而且会造成肠外多种器官损伤，如肺、心、肾、肝功能受损，甚至出现多脏器功能障碍综合征(MODS)。肺脏是最易受损的器官，急性肺损伤(ALI)是MODS发展中出现最早、发生率最高的临床症状，严重时可发展成急性呼吸窘迫综合征(ARDS)［6-7］，所以肠缺血再灌注引起的急性肺损伤倍受关注。

本实验证实了大鼠肠缺血1小时再灌注2小时可引起典型的急性肺损伤病理表现。文献报道［8］，肠缺血再灌注后，氧自由基造成的损害可能为重要的病理机制，并在肠缺血再灌注后的肺损伤中起重要作用。本研究的结果与之一致，肠缺血再灌注后，肺组织中SOD活性明显降低，MDA含量显著增高，与对照组相比差异非常显著，提示肠缺血再灌注后产生的氧自由基对肺血管内皮和肺泡细胞膜产生了明显损伤。

参附注射液具有稳定的强心升压作用，可改善微循环，防治脏器缺血-再灌注损伤，主要应用于创伤、休克及危重病患者的急救［9-12］。参附注射液采用10 mL/kg是根据临床使用后换算而来的相关剂量［13-17］。本研究发现:缺血再灌注组肺内组织HO-1表达增加，肺组织中SOD活性明显降低，MDA含量明显升高，氧合指数显著降低，肺组织出现典型的病理特征；当预防性地给予临床相关剂量的参附注射液和腹腔注射血红素加氧酶的诱导剂血晶素时，肺内HO-1表达明显增强，肺组织中MDA含量相应降低，而SOD活性显著增高，肺氧合指数明显改善［18-21］。组织病理学改变减轻，结果表明预防性应用临床相关剂量的参附注射液对肠缺血再灌注导致的急性肺损伤有明显的保护作用，当腹腔注射血红素加氧酶的抑制剂锌原卟啉IX时，尽管在缺血前预防性地给予临床相关剂量的参附注射液，但各项指标与I/R组差异无统计学意义(P＞0.05)，其保护作用不再呈现。提示SFI预处理对I/R肺损伤的保护作用可能与诱导HO-1的肺内高表达有关。

因此，临床相关剂量的参附注射液预处理减轻了肺组织的病理损伤，从而改善肺功能，提高机体氧输送能力，改善机体缺氧状态，有着广阔的临床应用前景和实用价值。其机制可能与上调HO-1蛋白表达、一定程度上抑制脂质过氧化、拮抗氧自由基的损伤有关，但其保护作用的确切机制尚需进一步研究。

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Preconditioning Effects of ShenFu Injection in Clinical Dosage on Acute Lung Injury of the Rats with Intestinal Ischemia-reperfusion

LIU Zhigang,FU Xiangyun,LIU Yongfang,HU Gang,XIE Hengtao
Anesthesia Department of People's Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China

Objective：To investigate the preconditioning effects of ShenFu Injection on acute lung injury of the rats with intestinal ischemia-reperfusion.Methods：Rat model with acute lung injury was prepared by intestinal ischemia-reperfusion.Forty rats were randomized into five groups,eight rats each group.The control group(group C)：superior mesenteric artery(SMA)was only separated but not blocked;injury group(I/R group)：SMA was blocked for one hour,and reperfusion for two hours,femoral vein received the injection of equivalent amounts of physiological saline as the control;ShenFu injection preconditioning group(SFPR group)：ShenFu injection,10 mL/kg, was pumped from femoral vein one hour before SMA was blocked;hemin group：the rats accepted peritoneal injection of hemin,75 μmol/kg,24 hours before SMA was blocked.ZnppIX+SFPR group：the rats received peritoneal injection of IX(20 mg/kg)24 hours before SMA was blocked,and subsequent operation was the same as SFPR group.The rats accepted peritoneal injection of physiological saline in the same amounts before the operation,and sacrificed by carotid artery bleeding in two hours after reperfusion.HO-1 expressions in lung tissues,the contents of MDA and SOD,the influences of lung permeability index,artery blood gas and W/D ratio were observed.Results：Compared with I/R group,HO-1 positive expressions raised in lung tissues of SFPR and Hemin groups,while lowered in ZnppIX+SFPR group(P＜0.05).Lung permeability index,the contents of MDA and W/D ratio decreased significantlyin SFPR and Hemin groups,SOD raised obviously(P＜0.05);compared with group C,lung permeability index,the contents of MDA and W/D ratio increased notably in I/R group,while SOD contents decreased notably (P＜0.05);PaO2and PaCO2decreased remarkably in other groups compared with group C(P＜0.05),while PaO2and PaCO2in SFPR and Hemin groups were higher than I/R group.Conclusion：Preconditioning by clinical use of ShenFu injection can significantly relieve acute lung injury induced by I/R in intestine,and the underlying mechanism could be associated with up-regulation of HO-1,inhibiting lipid peroxidation and oxidation injury antagonism.

reperfusion injury;lung;intestinal mucosa;heme oxygenase-1;ShenFu injection

R285.5

A

1004-6852(2016)10-0026-04

2016-02-27

刘志刚(1977—)，男，博士学位，副主任医师。研究方向:围术期脏器保护。