大剂量岷当归配伍川芎对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用*

巩 婷，李妍怡，杨瑞龙

甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050

大剂量岷当归配伍川芎对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用*

巩 婷，李妍怡，杨瑞龙

甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050

目的:通过观察大剂量岷当归配伍川芎对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能评分、脑梗死体积及脑组织中ICA M-l、CO X-2基因表达的影响，研究不同剂量岷当归配伍川芎对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及机制。方法:将60只雄性W i st ar大鼠60只，随机分为6组，即假手术组、模型组、尼莫地平组、岷当归高剂量+川芎组、岷当归中剂量+川芎组、岷当归低剂量+川芎组，每组各10只。模型采用大脑中动脉缺血模型。在造模前12小时、30分钟各给药1次，缺血后12、24、36、48小时各给药1次。缺血再灌注48小时将大鼠处死，留取标本。对各组大鼠进行行为学评估，采用TTC染色法检测各组大鼠脑梗死体积，免疫组化及RT-PCR检测ICA M-l、CO X-2m RN A的相对表达。结果:神经功能评分、梗死面积比率岷当归+川芎治疗组与尼莫地平组均低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。ICA M、CO X-2m RN A表达模型组与假手术组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，各治疗组与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；岷当归高剂量+川芎组与岷当归中剂量+川芎组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。结论:高、中剂量组岷当归与川芎配伍可以抑制脑缺血再灌注损伤过程的炎症反应，改善神经缺损症状，在一定程度上缩小缺血再灌注损伤后大鼠脑组织梗死体积，降低炎症因子在脑缺血再灌注损伤中的表达，从而减轻脑细胞的损伤。

岷当归；川芎；脑缺血再灌注损伤；ICA M-l；CO X-2

脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)是指脑缺血致脑细胞损伤，恢复血液再灌注后，其缺血性损伤反而进一步加重的现象。目前研究发现，脑缺血再灌注损伤机制复杂，参与因素很多，可能与兴奋性氨基酸、钙超载、自由基、一氧化氮等有关。其中，炎症反应在脑缺血再灌注损伤中的作用越来越受到重视［1］。大量证据表明，缺血和再灌注早期产生的黏附因子和细胞因子构成了缺血性损伤向炎症性损伤转变的基础［2］。ICAM-1是细胞黏附分子中免疫球蛋白家族成员，与炎症过程密切相关。环氧化酶(cyclooxygenase，COX)是催化花生四烯酸产生前列腺素类和血栓素物质的主要酶之一，在炎症过程中发挥重要的作用［3］。本研究通过观察不同剂量岷当归配伍川芎对大鼠脑缺血再灌注损伤后的神经保护作用，从抑制炎症因子的角度探讨了该作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 雄性SPF级Wistar大鼠60只(体质量250～320 g，鼠龄3～4月)，由甘肃中医学院科研实验中心提供，动物合格证号:SCXK (甘)201100001。按体质量随机分为6组，每组10只，分别是假手术组、模型组、尼莫地平组、岷当归高剂量+川芎组、岷当归中剂量+川芎组、岷当归低剂量+川芎组。

1.2 仪器与试剂 岷当归、川芎、3%戊巴比妥钠(购自甘肃中医学院科研实验中心药理毒理实验室)，尼莫地平(广东华南药业集团有限公司，国药准字H44025019)，TTC由上海中秦化学试剂有限公司提供；ICAM-l、β-actin引物基因(南京金斯瑞生物科技有限公司合成，-20℃保存，使用时用去RNA酶的灭菌双蒸水配制成所需浓度)，总RNA抽提试剂盒(大连宝生物有限公司生产)，RT-PCR反应试剂盒(大连宝生物有限公司生产)，XST-Ⅱ温控式大鼠解剖台(南京泉水教学仪器厂提供)，PLCO型台式高速离心机(德国Heraeus公司提供)，荧光定量PCR7300system仪(Applied Biosysterms公司提供)。

1.3 模型制备 通过改良Longa的方法采用线栓法阻塞大鼠单侧大脑中动脉制备缺血再灌注损伤模型。术前12小时禁食，术前1小时禁水。大鼠称重后予10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定，沿颈部正中切开，暴露CCA、ECA、颈内动脉ICA，永久结扎CCA近心端、ECA根部，微动脉夹暂时夹闭CCA远心端，在此处剪一斜口，经此口插入顶端光滑成球面的尼龙线，经CCA分叉处通过ICA入颅至ACA起始部，闭塞MCA起始部，造成了MCA供血区的梗死。尼龙线插入深度为18～20 mm，结扎CCA远心端后逐层缝合，尼龙线末端暴露在体外。栓塞2小时后，拔出尼龙线，实施再灌注。假手术组只分离、暴露血管，不阻塞血管。

1.4 给药方法 每组动物于造模前12小时、30分钟，缺血后12、24、36、48小时各给药1次，共6次。假手术组与模型组给予生理盐水20mL/(kg·d)；岷当归水煎液高、中、低剂量为2、1、0.5 g/kg，川芎常用量均为0.167 g/kg，对照组尼莫地平20 mL/kg(浓度1 g/L)，按照人与大鼠体表面积公式换算为动物用药剂量；缺血再灌注48小时将大鼠处死，留取标本。

1.5 神经功能评分 根据Longa的5级标准评分法，第1次动物苏醒后开始评分，直至动物死亡或被处死。0分:正常，未见任何神经功能缺损表现。1分:垂直提起时前爪不能伸直。2分:行走时身体向右倾，向右侧旋转。3分:行走时身体向右侧跌倒。4分:不能自发行走或有意识障碍。根据首次评分，没有神经功能缺损、有呼吸困难、提前死亡及处死时发现有蛛网膜下腔出血的动物均弃之不用，对于剔除的动物在后续的实验中补充。

1.6 计算脑组织梗死灶 于缺血再灌注实验断头取出鼠脑，置冰箱(-20℃)内30分钟后，取冠状面均匀切成2 mm厚脑片5～6片，每隔2 mm切一片(第一刀在脑前极与视交叉连线中点处；第二刀在视交叉部位)。将第3切片迅速置于2%TTC溶液(37℃)中染色。正常脑组织染成红色，缺血区呈灰白色，界线清晰。计算梗死组织占第3切片湿重的百分率。

1.7 RT-PCR检测m RN A表达水平 参照试剂盒说明，按步骤进行操作，各基因相应特异性引物如下:

ICAM-1上游引物:5′-CAG GTA TCC ATC CAT CCC-3′

ICAM-1下游引物:5′-CTG TTC AGA AGC ACC ACC-3′

COX-2上游引物:5′-GAG AGA AAG AAA TGG CTG CAG AG-3′

COX-2下游引物:5′-TTA CAG CTC AGT TGA ACG CCT T-3′

β-actin基因上游引物:5′-AGC CTT CCT TCC TGG GTATG-3′

β-actin基因下游引物:5′-ATC GTA CTC CTG CTT GCT GA-3′

1.8 数据处理 反应结束后，由PCR-7300仪分析界面分析COX-2、ICAM-1和β-actin基因的扩增曲线，得到各实验孔Ct值，分别计算同一cDNA样本4个复孔的Ct均值，以同一样本的β-actin Ct值作为内参，按照公式2-△△ct方法进行数据处理。

1.9 统计学方法 使用SPSS 13.0统计软件包进行数据处理，计量资料均以(s)表示，多组间比较采用单因素方差分析法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能缺损评分 假手术组未见神经功能缺损及梗死；神经功能缺损评分、梗死面积比率治疗组与模型组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)；岷当归中剂量+川芎组、模型组与尼莫地平组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)；岷当归低剂量+川芎组与岷当归中剂量+川芎组、岷当归高剂量+川芎组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)；岷当归中剂量+川芎组与岷当归高剂量+川芎组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。神经功能缺损评分，岷当归高剂量+川芎组与尼莫地平组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。梗死面积比率比较，2组差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 缺血再灌注损伤大鼠神经缺损症状评分表(s)

表1 缺血再灌注损伤大鼠神经缺损症状评分表(s)

注:●表示与模型组比较，P＜0.05；※表示与尼莫地平组比较，P＜0.05；▲表示与岷当归低剂量+川芎组比较，P＜0.05；◆表示与岷当归中剂量+川芎组比较，P＜0.05；★表示与尼莫地平组比较，P＜0.05；☆表示与尼莫地平组比较，P＞0.05。

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2.2 ICA M-l、CO X-2 m R N A的表达测定结果 ICAM-l和COX-2mRNA相对表达量假手术组、各治疗组与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；各治疗组与假手术组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；岷当归低剂量+川芎组、岷当归中剂量+川芎组、岷当归高剂量+川芎组与尼莫地平组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)；岷当归低剂量+川芎组与岷当归中剂量+川芎组、岷当归高剂量+川芎组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。岷当归中剂量+川芎组与岷当归高剂量+川芎组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 ICA M-l、CO X-2m RN A的相对定量表达测定结果(s)

表2 ICA M-l、CO X-2m RN A的相对定量表达测定结果(s)

注:●表示与模型组比较，P＜0.05；#表示与假手术组比较，P＜0.05；※表示与尼莫地平组比较，P＜0.05；▲表示与岷当归低剂量+川芎组比较，P＜0.05；☆表示与岷当归中剂量+川芎组比较，P＞0.05。

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3 讨论

正常情况下，ICAM-1在血管内皮细胞及其他细胞为低水平表达，但当组织损伤、缺血、炎症时，ICAM-1呈现高表达，引起一系列病理反应［4］，在中性粒细胞黏附迁徙的过程中ICAM-1起关键的桥梁作用［5］。COX-2在大多数正常组织中检测不到，可以被生长因子、细胞因子或其他的炎症介质所诱导。在涉及动脉粥样硬化研究中，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、氧化型低密度脂蛋白、自由基、内毒素、缺氧、血流动力学应激等均可诱导COX-2表达，在炎症过程中发挥重要的作用［3］。

当归配川芎，即佛手散，出自《普济本事方》，川芎为血中之气药，能上行头目，下行血海，与当归配伍可补血活血，使补血而不滞血，行血而不伤血，多用于营血瘀滞证。现代研究发现当归含有多种有效成分，当归多糖，多种氨基酸具有广泛的药理作用。醇提当归油既可抑制炎症早期的水肿与渗出，又可抑制炎症晚期的组织增生与肉芽组织形成。

本研究结果表明各中药治疗组大鼠神经缺损的症状、梗死体积均有不同程度的好转及缩小，以高、中剂量组最为显著，说明岷当归高、中剂量组可改善脑缺血再灌注后神经功能缺损症状、缩小梗死灶的体积，有效减轻脑缺血再灌注损失，保护受损神经细胞。而岷当归配伍川芎的这种神经保护作用可能是通过降低COX-2mRNA、ICAM-1mRNA的表达水平、抑制脑缺血再灌注损伤后的炎症反应而起到神经细胞保护作用。

［1］ 程道宾.脑缺血预处理对脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制［D］.武汉:华中科技大学，2007．

［2］ 高颖，周莉.中风病中医药防治研究的回顾与现状分析［J］.环球中医药，2009，2（1）:15-18.

［3］ 张小菊，王荔，高建英，等.高脂血症对脑缺血再灌注大鼠脑组织中M M P-9和CO X-2表达的影响［J］.中国临床神经科学，2011，19（3）:270-275.

［4］ 孙媛娇，王桂敏.脑出血后血肿周围炎症与自由基损伤机制［J］.医学综述，2008，14（1）:40-42.

［5］ 潘斌，刘素蓉，成涛，等.健脑益智口服液在脑缺血再灌注损伤中的神经保护作用及其机制［J］.中国临床康复，2004，8（7）:1306-1307.

The Protective Effects of Combination of MinDangGui and ChuanXiong in Large Doses on the Nerve Dysfunction Induced by Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury

GONG Ting,LI Yanyi,YANG Ruilong
Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730050,China

Objective：To study the protective effects and mechanisms of MinDangGui(Angelica sinensis) combined with ChuanXiong (Ligusticum wallichii)in different doses on the rats with cerebral ischemia reperfusion injury(CIRI)by observing the effects of MinDangGui and ChuanXiong in large doses on neural function scores, cerebral infarction size and ICAM-l and COX-2 gene expressions of the rat model.Methods：Sixty male Wistar rats were divided into six groups,the sham operation group,the model group,the nimodipine group,the high,moderate and low dosages groups of MinDangGui and ChuanXiong,ten rats each group.The model was prepared by middle cerebral artery occlusion.The rats were given drugs once separately about 12 hours and 30 minutes before modeling, in 12,24,36 and 48 hours after ischemia.They were sacrificed in 48 hours after ischemia reperfusion and the samples were kept.Behavioral assessment was performed for each group,cerebral infarction size of the rats in different groups was detected by TTC staining method,and meanwhile relative expressions of ICAM-1 and COX-2mRNA were measured by immunohistochemical method and RT-PCR.Results：The treatment group of MinDangGui and ChuanXiong was lower than the model group in neural function scores,cerebral infarction size rate, there were statistical differences(P＜0.05).When the model group was compared with the sham operation group in ICAM and COX-2mRNA expressions,there were statistical differences(P＜0.05),when all the treatment groups were compared with the model group,there were statistical differences(P＜0.05);when the high dosage group of MinDangGui and ChuanXiong was compared with the middle dosage group of MinDangGui and ChuanXiong,there was no statistical differences(P＞0.05).Conclusion：The high,middle dosages of MinDangGui and ChuanXiong can inhibit inflammatory reaction in the course of cerebral ischemia-reperfusion injury,improve neural defective symptoms,and reduce cerebral infarction size of the rats after ischemia-reperfusion injury to a certain degree,as well as lower inflammatory factor expression in cerebral ischemia-reperfusion injury,therefore it can alleviate the injury of cerebral cells.

MinDangGui;ChuanXiong;cerebral ischemia-reperfusion injury;ICAM-l;COX-2

R285.5

A

1004-6852(2016)10-0020-03

2016-04-25

2010年甘肃省自然科学基金项目(编号1010RJZA 215)。

巩婷(1979—)，女，博士学位，主治医师。研究方向:脑病的中医诊治。