膝骨性关节炎患者低密度脂蛋白受体相关蛋白5基因与中医体质相关性研究*

周明旺，李盛华，陈 娴，王 金，陈 威

甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050

膝骨性关节炎患者低密度脂蛋白受体相关蛋白5基因与中医体质相关性研究*

周明旺，李盛华，陈 娴，王 金，陈 威

甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050

目的:研究膝骨性关节炎(K O A)患者低密度脂蛋白受体相关蛋白5基因rs3736228位点多态性与中医体质的相关性。方法:对K O A患者进行中医体质问卷调查，对平和质、阳虚质、阴虚质3种高发体质的K O A患者进行LRP5基因多态性检测，同时随机选取54例健康非血缘关系志愿者作为对照组。结果:本次研究共检测出LRP5基因rs3736228位点三种基因型，分别为CC、TT、CT。病例组与对照组比较，各基因型及等位基因差异无统计学意义（P＞0.05）。平和质病例组、阳虚质病例组、阴虚质病例组分别与对照组比较，各基因型与等位基因差异无统计学意义（P＞0.05）。结论:LRP5基因rs3736228位点多态性可能与K O A无相关性。

骨性关节炎，膝；中医体质；LRP5；基因多态性

低密度脂蛋白受体相关蛋白5(low density lipoprotein receptor-related protein 5，LRP5)属于低密度脂蛋白受体家族，是Wnt/β-catenin信号通路中极其重要的信号蛋白［1］。相关研究显示，LRP5通过影响软骨细胞中Ⅱ型胶原、MMP-3、MMP-13的水平，在Wnt/β-catenin信号通路介导的骨性关节炎软骨退变中发挥至关重要的作用［2-3］。近年来，中医体质学揭示疾病病因病机的独特优势逐渐受到重视，相关流行病学调查显示中医体质与膝骨性关节炎(knee osteoarthritis，KOA)的发病关系密切。本研究通过探讨KOA患者LRP5基因rs3736228位点多态性与其中医体质的关系，尝试阐明KOA患者高发体质发病的内在生物学基础，为辨识体质防治KOA提供科学依据。现报道如下:

1 资料与方法

1.1 临床资料 2014年2月至2015年6月在甘肃省中医院关节骨科、骨伤病科门诊和住院部的KOA患者进行问卷调查，将调查病例所得数据资料录入Excel表格建立数据库。从数据库中筛选出阳虚质KOA患者37例、阴虚质KOA患者20例、平和质KOA患者39例为病例组。随机选取健康非血缘关系志愿者54例作为对照组。

1.2 纳入标准 纳入:1)受试者签订知情同意书；2)研究方法经医院伦理委员会讨论并获得批准。

1.3 排除标准 排除:1)诊断为创伤性KOA的患者；2)妊娠或哺乳期妇女，过敏体质者或不能接受本调查者；3)类风湿性关节炎、强直性脊柱炎及患有严重膝关节疾病者；4)合并有严重的内脏病变者或其他严重代谢异常疾病及骨肿瘤患者；5)精神病患者、智力障碍者；6)正在参加其他临床试验的患者。

1.4 方法

1.4.1 血液D N A提取 使用北京百泰克生物技术有限公司生产的中量全血基因组DNA提取试剂盒(溶液型)自全血中提取DNA，提取过程中可见白色的DNA絮状物，加入DNA溶解液水化后存放在2～8℃冰箱保存，长时间存放，可放置在-20℃冰箱。

1.4.2 PCR扩增 选择LRP5基因的SNP位点为rs3736228，从文献［4］中得到该位点的上下游引物碱基序列，将该序列进行验证后委托上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。扩增引物序列:上游:5′-GCT GGG CTG TTG ATG TTT AGA-3′；下游:5′-AGA GGC AAG GTT TTC CCA TAA-3′。PCR反应体积共25μL，其中2×EsTaqMasterMix12.5μL，上游引物(ρ=10 μM)1μL，下游引物(ρ=10 μM) 1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。将上述体系加入0.5 mL EP管后瞬时离心，防止液体附壁，再放入PCR仪扩增得到产物。PCR反应条件:94℃预变性2分钟；循环参数:94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；最后延伸:72℃，2分钟，保存温度4℃。

1.4.3 凝胶电泳 将PCR扩增产物5 μL及DNA Marker 6 μL进行凝胶电泳，电泳电压120 V，电泳20分钟，待条带移动到距凝胶前沿约2 cm时，停止电泳。将电泳后的胶板放入凝胶成像仪中进行观察和拍照。

1.4.4 PCR产物测序分析 凝胶电泳后运用凝胶成像仪观察产物，挑选出成像明显的PCR产物进行测序分析，测序工作委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.5 统计学方法 采用Excel建立数据库，SPSS 19.0软件统计分析。通过χ2检验分析病例组与对照组及病例组间各基因型与等位基因分布差异，以P＜0.05认为具有统计学差异。若χ2检验分析有意义则进一步进行logitic分析，寻找有显著差异的基因型和等位基因，以P＜0.05认为具有统计学差异。

2 结果

2.1 PCR扩增结果 PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶液电泳后，在相应位置有清晰的DNA条带，长度与DNA Marker指示位置一致，表明为LRP5基因位点相应序列的PCR扩增结果。结果见图1。

图1 PCR扩增产物跑胶结果

2.2 基因测序结果

2.2.1 LRP5基因rs3736228位点测序结果 PCR扩增产物的基因测序结果经chromas、BioEdit软件分析后，LRP5基因位点共检测出CC、TT、CT 3种基因型，见图2。

图2 LRP5基因rs3736228位点测序结果

2.2.2 K O A患者中医体质与LRP5基因rs3736228位点多态性的关系 LRP5基因rs3736228位点多态性病例组与对照组比较，总体上各基因型等位基因分布无明显差异(χ2=0.56，P＞0.05；χ2=0.067，P＞0.05)。见表1。

表1 LRP5基因rs3736228位点病例组与对照组基因型、等位基因分布

LRP5基因rs3736228位点，阳虚质病例组与对照组比较，总体上各基因型无统计学意义(χ2=0.209，P＞0.05)，等位基因分布差异无统计学意义(χ2=0.129，P＞0.05)；阴虚质病例组与对照组比较，总体上各基因型及等位基因分布差异无统计学意义(χ2=0.355，P＞0.05；χ2=0.169，P＞0.05)；平和质病例组与对照组比较，总体上各基因型及等位基因分布差异无统计学意义(χ2=2.288，P＞0.05；χ2=0.511，P＞0.05)。见表2。

表2 阳虚质、阴虚质、平和质病例组与对照组LRP5基因rs3736228位点基因型、等位基因分布

3 讨论

本研究通过基因测序分析LRP5基因rs3736228位点与KOA高发体质阳虚质、阴虚质、平和质之间的关系，结果显示KOA患者中LRP5基因rs3736228位点共检测出3种基因型，分别为CC型、TT型、CT型。3种基因型及等位基因分布频率在病例组与对照组中差异无统计学意义。进一步将阳虚质、阴虚质、平和质病例组与对照组进行两两比较，各基因型及等位基因分布也无统计学差异。提示LRP5基因rs3736228位点多态性可能与KOA的发病无关。

LRP5蛋白是一种跨膜受体蛋白，其基因位于染色体11q-13上，由1615个氨基酸组成，包含23个外显子。该基因rs3736228多态性位点位于编码LDL受体结构域的18号外显子［3］。以往研究显示，该位点的突变与骨质疏松、骨折、糖尿病等有关，但与KOA相关性的研究较少。国外学者［4］曾对鹿特丹及英国青福德OA患者该位点的多态性进行检测，发现该位点多态性与髋、膝、手指间关节的OA影像学K/L分级及患者血清CTX-Ⅱ水平无相关性。本次研究结果也显示LRP5基因rs3736228位点多态性与KOA无明显关联。由于纳入标准不同以及研究对象的异质性，虽然两次研究均为阴性结果，尚不能认为该位点与KOA无关。此外，多个文献支持LRP5蛋白通过Wnt/β-catenin信号通路在KOA发病、发展过程中的重要作用［5］，我们不能排除由该基因突变导致KOA可能不止rs3736228一个位点，尽管该位点的突变被认为是调控Wnt信号通路重要原因。

本研究的不足之处在于:首先研究的病例数较少；其次病例组患者存在多种混杂因素，如KOA病情严重程度、性别、年龄、伴发其他一些疾病；再次选择单个基因的单个位点进行研究。以上这些情况都可能对最后的结果造成偏倚，因此上述结果尚需要在多地区进行设计严谨、大样本、多个位点多态性的研究予以验证，从而阐明LRP5基因多态性影响KOA的机制，为KOA的辨识体质防治提供更科学的诊疗指标，为临床个体化药物治疗和预防KOA提供帮助。

［1］ 乔斌，李盛华，周明旺，等.W nt/β-cat eni n信号通路与软骨代谢相关性研究进展［J］.中国中医骨伤科杂志，2014，22(10)：75-77.

［2］ Shi n Y，H uh Y H，K i m K，etal.Low-densi t y l i poprot ei n recept or-rel at ed prot ei n 5 governsW ntm edi at ed ost eoart hri t i c cart i l age dest ruct i on［J］.A rt hri t i s Res Ther，2014，16(1):37-42.

［3］ 尤海菲.LRP5基因多态性、环境因素及其交互作用与2型糖尿病的关联研究［D］.郑州：郑州大学，2014：38-48.

［4］ K erkhofJM，U i t t erl i nden A G，V al des A M，etal.Radi ographi c ost eoart hri t i s at t hree j oi nt si t es and FRZB，LRP5，and LRP6 pol ym orphi sm s i n t w o popul at i on-based cohort s［J］.O st eoart hri t i s Cart i l age，2008，16(10)：1141-1149.

［5］ Papat hanasi ou I，M al i zos K N，Tsezou A.Bone m orpho genet i c prot ei n-2-i nduced W nt/β-cat eni n si gnal i ng pat hw ay act i vat i on t hrough enhanced l ow-densi t yl i poprot ei n recept or-rel at ed prot ei n 5 cat abol i c act i vi t y cont ri but es t o hypert rophy i n ost eoart hri t i c chondrocyt es［J］.A rt hri t i s Res Ther，2012，18，14(2)：82-89.

Relevant Study on Low-density Lipoprotein Receptor-related Protein 5 Gene and TCM Constitutions of the Patients with Knee Osteoarthritis

ZHOU Mingwang,LI Shenghua,CHEN Xian,WANG Jin,CHEN Wei
Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730050,China

Objective：To study the relationship between low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (LRP5)Gene：site polymorphism of rs3736228 and TCM constitution of the patients with knee osteoarthritis(KOA). Methods：Questionnaire survey of TCM constitution was conducted in patients with KOA,LRP5 gene polymorphism was detected in KOA patients of specific,Yang-deficiency and Yin-deficiency constitutions,and 54 healthy non-genetic connection volunteers were selected randomly as the control group.Results：Three genetic types of rs3736228 site of LRP5 gene were detected in this study,and they were CC,TT and CT.patients group compared withthecontrolgroup,therewerenostatisticaldifferencesinthecomparisonofallkindsgenotypesandalleles(P＞0.05). Specific cases group,Yang-deficiency cases group and Yin-deficiency cases group compared with the control group separately,there were no statistical differences in all kinds of genotypes and alleles(P＞0.05).Conclusion：There might be no correlation between rs3736228 site morphism of LRP5 gene and KOA.

osteoarthritis,knee;TCM constitution;LRP5;gene polymorphism

R684.3

A

1004-6852(2016)10-0005-03

2016-05-27

甘肃省自然科学基金项目(编号1208RJZA 041)。

周明旺(1977—)，男，博士学位，副主任医师。研究方向:中医药防治骨与关节疾病。