山东仁瓜蒌的HPLC指纹图谱研究*

宋艳梅，刘亚鲁，李 峰△

1山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2山东大学齐鲁儿童医院药剂科

山东仁瓜蒌的HPLC指纹图谱研究*

宋艳梅1，刘亚鲁2，李 峰1△

1山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2山东大学齐鲁儿童医院药剂科

目的:建立山东仁瓜蒌的高效液相色谱法(H PLC)指纹图谱。方法：采用A gi l ent ZO RBA X SB-C18色谱柱（4.6 m m×250 m m，粒度5 μm），以甲醇-水（95∶5）为流动相进行梯度洗脱，流速1 m L/m i n，柱温25℃，检测波长230 nm，进样量20 μL。结果:建立了山东仁瓜蒌的H PLC指纹图谱，方法学考察结果良好，确立了9个共有峰，其中1个共有峰得到确认，10批仁瓜蒌药材的H PLC指纹图谱的相似度均＞0.95。结论:该方法重复性、稳定性良好，建立的指纹图谱可为山东仁瓜蒌药材的质量评价提供依据。

仁瓜蒌；高效液相色谱法；指纹图谱

瓜蒌(Trichosanthis fructus)为葫芦科栝楼属植物栝楼（Trichosanthes kirilowii Maxim）或双边栝楼（Trichosanthes rosthornii Harms）的干燥成熟果实，具有清热涤痰、宽胸散结、润燥滑肠的功效［1］。瓜蒌的原植物可分为栝楼和双边栝楼，其植株形态、果实的外形和质量差异显著，其中“仁瓜蒌”为山东省栽培瓜蒌的主流品种，量大质优。高效液相色谱法(HPLC)中药指纹技术是目前判断中药材真伪，评价质量优劣综合的、可量化的鉴别手段。为实现瓜蒌的规范化种植，保护仁瓜蒌种质资源，为仁瓜蒌质量控制提供依据，我们对山东10批仁瓜蒌样品进行了HPLC指纹图谱研究。

1 材料与方法

1.1 药材 取仁瓜蒌成熟果实，自然阴干后，铁研船研磨，过40目筛，备用。供试材料经山东中医药大学药学院李峰教授准确鉴定，材料来源见表1。

表1 10批山东仁瓜蒌药材样品

1.2 仪器和试剂 高效液相色谱仪(AGILENT1100)；色谱柱(Agilent ZORBAX SB-C18柱，4.6 mm×250 mm，粒度5 μm)；KQ-250E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司提供)；甲醇(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司提供，批号：20131126)；娃哈哈纯净水。

1.3 方法［2-5］

1.3.1 供试品溶液制备方法的优选 精密称取粉碎后过40目筛的瓜蒌成熟果实5.0 g，分别选用甲醇、50%甲醇、乙醇、氯仿、乙醚和石油醚100 mL为溶剂，30分钟超声波振荡提取，抽滤，挥去溶剂，甲醇定容至10 mL，0.45 μm微孔滤膜滤过，HPLC分析，流速为1 mL/min，吸收波长：230 nm，流动相为甲醇∶水=97∶3，记录60分钟色谱图，选出适宜的提取溶剂。

1.3.2 高效液相色谱条件的选择

1.3.2.1 检测波长的选择 精密称定瓜蒌粉末5.0 g，上述方法制备样品液后采用甲醇和水梯度洗脱，在190～400 nm全波长下扫描，选择能够较多显示瓜蒌化学成分信息的波长，进一步进行波长优选，最后根据优选结果，选择检测波长为230 nm。见图1。

图1 瓜蒌H PLC3D光谱图

1.3.2.2 洗脱条件的选择 精密称取瓜蒌样品粉末5.0 g，以氯仿为溶剂，超声波振荡30分钟提取，过滤，挥干氯仿，甲醇定容至10 mL，0.45 μm微孔滤膜滤过，柱温25℃，流速1 mL/min，进样量20 μL，检测波长230 nm，分别采用以下洗脱条件进行HPLC分析。洗脱条件1，甲醇∶水=97∶3作为流动相，非梯度洗脱60分钟。洗脱条件2，见表2。洗脱条件3，见表3。

表2 洗脱条件2

1.3.3 对照品实验 2010年版《中华人民共和国药典》(一部)未对瓜蒌药材的标准品做出规定，程雪梅等［6］经实验证实3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇是瓜蒌中含有的一种有效成分，具有很好的专属性和稳定性，所以我们选择3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇作为仁瓜蒌HPLC指纹图谱分析的对照品。吸取上述对照品溶液20 μL，按优选的高效液相色谱条件洗脱，确定对照品的位置，记录色谱图。

1.3.4 方法学考察

1.3.4.1 精密度实验 取第1批仁瓜蒌样品粉末5.0 g，精密称定，以优选出的方法制备样品液，连续进样6次进行测定，结果表明，峰面积占总峰面积2%以上的色谱峰，其相对保留时间的RSD值均小于0.9993%，相对保留峰面积的比值均小于2.398%，均在3%以内，符合指纹图谱技术要求。

1.3.4.2 稳定性实验 取第4批仁瓜蒌样品粉末5.0 g，精密称定，以优选出的方法制备样品液，分别在0、4、8、16、24、48小时检测，结果表明，峰面积占总峰面积2%以上的色谱峰，其相对保留时间的RSD值均小于0.7555%，相对保留峰面积的比值均小于2.6093%，均在3%以内，符合指纹图谱技术要求。

1.3.4.3 重现性实验 取第9批仁瓜蒌样品粉末5.0 g，精密称定，共取6份，以优选出的方法制备样品液，分别进行测定。结果表明，峰面积占总峰面积2%以上的色谱峰，其相对保留时间的RSD值均小于0.8311%，相对保留峰面积的比值均小于2.6861%，均在3%以内，符合指纹图谱技术要求。

1.3.5 10批仁瓜蒌的H PLC指纹图谱研究 采用上述条件对山东10批仁瓜蒌进行HPLC指纹研究，运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004年版》对10批仁瓜蒌样品的HPLC指纹图谱进行匹配和相似度分析。

2 结果

2.1 制备方法优选 结果表明采用石油醚、乙醚、氯仿、50%甲醇、甲醇、乙醇提取，所得HPLC色谱峰数目、峰形相差较大，其中氯仿提取所得的色谱峰数目较多，峰强度较高，结合瓜蒌中含有较多的三萜皂苷类化合物的极性特点，以及色谱分离的情况，选择氯仿作为提取溶剂，超声波振荡30分钟提取较适宜。

2.2 色谱条件的选择 根据检测波长优选结果，选择检测波长为230 nm。采用3种洗脱条件洗脱结果见图2—4。

图2 洗脱条件1 H PLC色谱图

图3 洗脱条件2 H PLC色谱图

图4 洗脱条件3 H PLC色谱图

由图可知，在洗脱条件1下，除去溶剂峰和杂质峰，分离得到9个色谱峰，色谱峰分离度较好，但是峰强度较弱，后30分钟没有色谱峰分离。在洗脱条件2下前30分钟基本没有分离出色谱峰，后10分钟有3个峰分离，但是由于时间较短，峰没有分离完全，而且分离度不好。在洗脱条件3下，除去溶剂峰和杂质峰，得到色谱峰数目最多，色谱峰分离度较好。综合所得色谱峰的数目、分离度、强度等因素，本实验采用洗脱条件3。

综上所述，本实验采用氯仿作为提取溶剂，超声波震荡30分钟提取，柱温25℃，采用洗脱条件3，选择230 nm作为检测波长进行仁瓜蒌HPLC指纹图谱研究。

2.3 对照品实验 选择3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇作为仁瓜蒌HPLC指纹图谱分析的对照品。吸取上述对照品溶液20 μL，按优选的高效液相色谱条件洗脱，确定对照品的位置，记录色谱图，结果见图5。

图5 对照品溶液H PLC图谱

2.4 山东仁瓜蒌指纹图谱测定

2.4.1 共有峰的标定 按照本研究方法检测山东l0批仁瓜蒌药材的HPLC指纹图谱，并运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004年版》对山东10批仁瓜蒌样品的HPLC指纹图谱进行了匹配，所得匹配图谱见图6。

图6 10批山东仁瓜蒌的H PLC匹配图谱

参考国家食品药品监督管理局制定的《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》［3］，经过对上述10批样品的测试分析和研究比较，并运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004年版》，以中位数法生成10批仁瓜蒌药材的对照指纹图谱归纳确定山东仁瓜蒌的HPLC指纹图谱具有9个共有的基本特征峰，如图7所示。

图7 山东仁瓜蒌的H PLC对照指纹图谱

描述如下：仁瓜蒌的指纹特征峰从左到右依次为：1号峰右侧带有1个肩峰；2号为1个尖峰，分离较好，峰强度较高；3号、4号、5号为3个单峰，3号峰虽较小，但分离较好，相对保留时间和面积最为稳定；6号为1个尖峰，比较稳定；7号峰比较稳定；8号峰形宽而且较低；9号为1～2个连续峰。

比较图6—7各特征峰的保留时间与图5中3,29-二苯甲酰基栝楼仁三醇标准品峰的保留时间可知，瓜蒌指纹图谱中3号峰为3,29-二苯甲酰基栝楼仁三醇的吸收峰，此峰可作为山东仁瓜蒌指纹图谱的内标参照峰。

2.4.2 相似度评价 运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004年版》对山东10批仁瓜蒌的相似度进行分析，分析结果见表4。

表4 山东10批仁瓜蒌相似度比较

由相似度比较结果可知，10批山东仁瓜蒌药材的HPLC指纹图谱的相似度均大于0.95，说明这10批样品质量相对较稳定，符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》规定，因此，所建立的仁瓜蒌HPLC对照指纹图谱合格，可作为山东仁瓜蒌药材的标准图谱。

3 讨论

3.1 参照物的选择 由于2010年版《中华人民共和国药典》(一部)未对瓜蒌药材的标准品做出规定，经查阅关于瓜蒌对照品文献报道较少，程雪梅等［6］经实验证实3,29-二苯甲酰基栝楼仁三醇是瓜蒌中含有的一种有效成分，具有很好的专属性和稳定性，可作为瓜蒌质量评价的指标之一。经反复实验证实，山东仁瓜蒌指纹图谱的3号峰为3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇的吸收峰，其峰形虽然较小，但是峰分离度较好，而且相对保留时间和面积最为稳定，所以我们选择3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇吸收形成的3号共有峰作为山东仁瓜蒌指纹图谱的内标参照峰。

3.2 测定方法的选择

3.2.1 检测波长的选择 本研究利用Agilent DAD检测器具有的所有模式储存采集光谱图的特点，通过从光谱图数据中筛选信号，获得分离色谱峰信息较多的检测波长210、220、230、240、250 nm。经过比较220 nm和230 nm检测波长下的主要色谱峰的保留时间和峰型相似，但是以230 nm为检测波长的色谱图中色谱峰分离较好、出峰时间较短、分离强度较高，且与相关文献［6］报道吻合，所以本实验选用230 nm作为检测波长。

3.2.2 流动相的选择 由于瓜蒌药材成分复杂，选用单一流动相难以很好的分离，需采用梯度洗脱才能达到较好的分离效果。梯度洗脱是流动相中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在洗脱过程中连续或间断改变流动相组成，以调节流动相的极性使每个流出的组分获得最理想的分离效果，并使样品中的所有组分在最短的分析时间内以适宜的分离度获得较好的选择性分离。经梯度洗脱分离的瓜蒌各共有色谱峰峰型尖锐，分离较好。在实验中，选用了文献报道中常用的甲醇∶水作为流动相进行考察，经反复试验摸索，结果表明，以甲醇∶水=95∶5(洗脱条件3)进行梯度洗脱分离的效果最好。

3.3 相似度分析 由相似度比较结果可知，10批山东仁瓜蒌药材的HPLC指纹图谱的相似度均大于0.95，说明这10批样品质量相对较稳定，符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》规定，因此，所建立的仁瓜蒌HPLC对照指纹图谱合格，可作为山东仁瓜蒌药材的标准图谱。

山东仁瓜蒌HPLC指纹图谱的建立为保证瓜蒌药材的质量，建立完善瓜蒌的质量控制关键技术和评价标准提供了依据。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010年版一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2010:104．

［2］ 周凤琴，徐凌川，张永清，等.山东瓜蒌生产情况调查［J］.山东中医药大学学报，2002，26(5):379-381．

［3］ 国家食品药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)［J］.中成药，2000，22(10):671-675.

［4］ 周涛，黄璐琦，江维克.高效液相色谱法测定大方油栝楼药材中葫芦素B的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2008，1(6): 4-5.

［5］ 时岩鹏，姚庆强，刘拥军，等.栝楼化学成分的研究及其α—菠菜甾醇的含量测定（Ⅰ）［J］.中草药，2002，33(1):15-16.

［6］ 程雪梅，吴弢，俞桂新，等.RP-H PLC法测定瓜蒌子中3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇的含量［J］.药物分析杂志，2005，25 (4):377-380.

Study in HPLC Fingerprint of RenGuaLou from Shandong Province

SONG Yanmei1,LIU Yalu2,LI Feng1△
1 School of pharmacy of Shandong University of traditional Chinese medicine,Jinan 250355,China;
2 Pharmacy Department in Qilu Children's Hospital of Shandong University

Objective:To establish HPLC fingerprint of RenGuaLou(trichosanthis)from Shandong Province. Methods:The HPLC method was used on an Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm,5 μm）chromatographic column with methanol-water(95:5)as mobile phase in gradient elution at the detection wavelength of 230 nm with the flow rate of 1 mL/min，and the column temperature was 25℃,the sample injection was 20 μL.Results:The HPLC fingerprint of RenGuaLou from Shandong Province was established．The methodological investigation result was good．Nine common peaks were existed in the fingerprint and one common peaks were confirmed．The similarities of ten batches of herb trichosanthis were greater than 0.95.Conclusion:The method holds a good stability and a well repeatability,and the established fingerprint can provide a basis for quality evaluation for herb RenGuaLou from Shandong Province．

RenGuaLou;HPLC;fingerprint

R284.1

A

1004-6852(2016)08-0024-05

2015-12-09

山东省科技发展计划项目(编号2007G G 2N S02052)。

宋艳梅(1977—)，女，博士学位，讲师。研究方向：中药资源开发与质量控制。

△通讯作者：李峰(1957—)，男，博士学位，博士研究生导师，教授。研究方向：中药质量控制研究。