甘肃不同产地冬虫夏草品质特征研究*

康红梅，李花花，顾春华，慕婷婷，苏 苌

1甘肃省科学院生物研究所，甘肃 兰州；2甘肃省产品质量监督检测中心；3甘肃中医药大学

甘肃不同产地冬虫夏草品质特征研究*

康红梅1，李花花1，顾春华2，慕婷婷3，苏 苌1

1甘肃省科学院生物研究所，甘肃 兰州；2甘肃省产品质量监督检测中心；3甘肃中医药大学

目的：了解甘肃产冬虫夏草的品质特征。方法：以甘肃（天祝、积石山、玛曲、尕海和夏河）和青海（同仁）产冬虫夏草为研究对象，采用高效液相色谱仪(H PLC)和比色法测定其主要有效成分含量。结果：甘肃产冬虫夏草个体较小[（0.1044±0.005）～（0.1904±0.009）g/株]。各产地冬虫夏草腺苷和甘露醇含量差异不明显，分别为（0.320±0.088)～(0.613±0.076)m g/g和(1.66±0.09)～(2.23±0.07)m g/g；嘌呤含量差异显著，积石山和玛曲的含量较高；虫草多糖含量最高的是天祝和积石山的样品，同仁最低；麦角甾醇含量以同仁产的最高，但与天祝和夏河产冬虫夏草的差异不明显。结论：甘肃各产地冬虫夏草个体较小，主要有效成分含量与青海产虫草差异不大，具有较高的品质。

冬虫夏草；有效成分；品质；高效液相色谱分析;甘肃

冬虫夏草［Cordyceps sinensis(Berk)sacc］是国家二级保护的名贵药材，主要分布在青海、云南、四川、西藏和甘肃等省区。甘肃虫草主要分布于碌曲、李恰如、尕海加仓、玛曲大水、尼玛、欧拉秀玛、阿万仓大山，这些地区是甘南以至甘肃冬虫夏草的主产地，有人认为所产品种是虫草新种［1］，但也有证据证明甘肃虫草与冬虫夏草是同种异名［2］。近年来研究者用不同的方法对冬虫夏草及菌丝体的有效成分进行了广泛的研究，发现其成分包括虫草多糖、蛋白和氨基酸、D-甘露醇、脂肪和脂肪酸、虫草素和生物碱、抗菌活性物质、微量元素、免疫抑制剂等。冬虫夏草有效成分含量因产地、居群以及子座、虫体部分不同而存在显著差异。目前对虫草质量的评估尚未形成统一标准［3］。如何选取一种（或几种）特征性的生物活性物质做为质量评价和质量控制标准显得十分重要。甘肃虫草做为我国虫草资源的重要组成部分，若其品质特征不清，不仅会影响甘肃虫草保护和科学开发利用政策的制定，而且会影响甘肃虫草的市场竞争力，严重制约虫草产业在甘肃的发展。本研究拟选取甘肃不同产区的冬虫夏草为材料，通过分析主要有效成分的差异来了解甘肃虫草的品质特征，为进一步提出虫草品质评价和质量控制标准提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 从甘肃天祝、积石山、尕海、夏河、玛曲以及青海同仁采集或购买当天采挖的新鲜虫草样品用硅胶快速干燥，运回实验室低温烘干，称重，粉碎后低温保存。

1.1.2 标准品 腺苷(批号：110879)、虫草素(批号：110858)、腺嘌呤(批号：110886)、麦角甾醇(批号:111845)均购自北京世纪奥科生物技术有限公司。N6-(2-羟乙基)腺苷(批号：11111123)购自上海同田生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 虫草大小 选取各产区样品15～30根，分析天平精确称重。

1.2.2 核苷类 腺嘌呤、腺苷、虫草素、N6-(2-羟乙基)腺苷，采用HPLC法测定(Waters 2695高效液相色谱仪，美国Waters公司提供)。准确称取0.06 g混合虫草粉末，加入3 mL蒸馏水，用超声波震荡提取25分钟(300 W，59 kHz)，10 000 r/min离心5分钟，取上清用0.22 μm滤膜抽滤(美国Sigma公司)，得供试样品。

色谱条件：色谱柱为Krommasil 100-5C18柱，流动相为［0.01 mol/L KH2PO4∶甲醇(90∶10)］，进样体积10 μL，柱温45℃，运行时间25分钟，检测波长为260 nm。腺嘌呤、腺苷、N6-(2-羟乙基)腺苷。见图1。

图1 100 μg/m L腺嘌呤、腺苷、虫草素、N 6-(2-羟乙基)腺苷四种混标

1.2.3 虫草酸 (D-甘露醇) 样品制备方法同“1.2.2”项，采用高碘酸钠比色法测定D-甘露醇含量［4］。

1.2.4 虫草多糖 采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定虫草多糖的含量［5］。

1.2.5 麦角甾醇 采用高效液相色谱汉(HPLC)测定(Waters2695高效液相色谱，美国Waters公司提供)，取0.1g粉末状样品，加入10倍体积的甲醇，并于冰浴中超声振荡10分钟；以10 000 r/min离心5分钟，收集上清液；其沉淀物再加入10倍体积的甲醇重复提取及离心，合并上述上清液；以0.22 μm滤膜 (美国Sigma公司提供)过滤；取20 μL滤液进行HPLC分析［6］。色谱条件：色谱柱Krommasil 100-5C18柱，流动相为100%甲醇，进样体积为20 μL，柱温30℃，运行时间20分钟，检测波长为282 nm麦角甾醇含量。见图2。

图2 标准品：0.2 m g/m L麦角甾醇

1.3 统计学方法 每个实验均重复3次，利用SPSS 15.0统计分析软件对所测的数据进行处理分析。计量资料用(±s)表示，采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 虫草大小 各产地冬虫夏草大小如表1所示，青海产虫草个体最大，达(0.211 2±0.024)g/株，显著高于甘肃各地的虫草。天祝虫草个体最小(0.104 4±0.005)g/株，重量约为青海虫草的一半，其余各地虫草个体大小差异不明显(0.157 6± 0.006)～(0.1904±0.009)g/株。见表1。

2.2 核苷类物质 共检测了4种核苷类物质［腺嘌呤、腺苷、虫草素、N6-(2-羟乙基)腺苷］。在所有供试样品均未检出虫草素(3′-脱氧腺苷)。N6-(2-羟乙基)腺苷也仅在积石山和玛曲的样品中检出(分别为7.116 μg/g，8.465 μg/g1次，重复后没有检出。各产区虫草腺苷含量如图3-A所示。甘肃尕海的虫草腺苷含量最高（0.613±0.076)mg/g，其次为青海同仁虫草（0.52±0.112)mg/g，积石山和夏河的虫草腺苷含量最低，但甘肃虫草与同仁虫草的腺苷含量差异不明显。各产区虫草嘌呤的含量如图3-B所示。玛曲和积石山虫草样品的嘌呤含量显著高于其他虫草(42.466±15.276)μg/g和(32.048±4.658)μg/g，天祝虫草嘌呤含量最低（8.222±0.962)μg/g，夏河与尕海虫草嘌呤含量与同仁的相近，含量居中。

表1 样品的来源和个体大小

图3 甘肃各产地冬虫夏草主要有效成分含量

2.3 其他有效成分 甘肃各产地虫草的甘露醇含量为(1.66±0.09)～(2.23±0.07)mg/g，与青海同仁的含量相似，差异不明显，如图3-C所示。各产区虫草多糖含量如图3-D所示。积石山和天祝虫草中虫草多糖含量最高(156.7±6.4)和(156.1± 6.5)mg/g，同仁的最低(97.2±4.3)mg/g，尕海、夏河和玛曲的虫草多糖含量居中。各产区虫草麦角甾醇含量如图3-E所示。同仁虫草麦角甾醇含量最高(50.247±2.25)μg/g，但与夏河、天祝的虫草差异不明显；甘肃其他地方虫草麦角甾醇含量差异不大，在(30.661±2.536)～(36.756±4.84)μg/g之间。

3 讨论

冬虫夏草是我国传统的滋补强壮药，含有虫草多糖类、核苷类、糖醇、甾醇类、氨基酸、肽类、维生素类、无机元素、多胺类及甘露醇等多种活性成分［7-8］。《中国药典》［9］(2010年版)对冬虫夏草的质量控制也仅有性状描述和腺苷的含量测定2项指标，但腺苷既不是特异性指标成分，也不是主要有效成分，不能科学评价虫草质量。虫草素(Cordycepin)，又名虫草菌素、蛹虫草菌素、3′-脱氧腺苷，是1950年Cunningham等人于蛹虫草中分离出的一种抗菌物质。虫草素是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素，具有抑菌、抗肿瘤、抗炎等非常广谱的生物学活性，对多种疾病都有潜在的治疗作用。Holliday曾提出N6-（2-羟乙基）腺苷是一种具活性的物质，连同腺苷和脱氧核苷统称为羟乙基腺嘌呤核苷类物质(Hydroxyethyl adenosineanalogs，HEAA)，可用作虫草不同菌株和生产方法的定性和定量质控标准［10］。近年来自然界中冬虫夏草是否含有虫草素一直存在争议［11］。有部分研究表明冬虫夏草中含有及少量虫草素［12-13］，但在本研究中，所有样品均未检出3′-脱氧腺苷和 N6-(2-羟乙基)腺苷，说明以HEAA含量作为虫草质量标准之一还需进一步的研究来确定。

目前对于虫草质量没有严格的标准。市场上多以虫体大小为冬虫夏草分等级，个体越大等级越高，价格越高。甘肃各产地的虫草个体明显小于青海产虫草，但从所检测的有效成分含量来看，并不比同仁虫草低，有些指标甚至更高。总体来看，甘肃虫草腺苷和甘露醇的含量与青海虫草相似，差异不明显；嘌呤和虫草多糖含量较高；麦角甾醇含量较低，但夏河与天祝虫草含量较高。因此，用虫体大小评价虫草品质是不科学的。甘肃虫草与青海同仁虫草品质差异不大。甘肃虫草具有较高的药用价值。

［1］ Zhang K Y，W ang ChG，Y an M Sh.A new speci es of Cordyceps fromG ansu，Chi na［J］.Trans M ycol Soc Japa，1989，30(2):295-299.

［2］ K ang JCh，Li ang ZQ，Li u A i Y，et al.M ol ecul ar evi dence of pol ym orphi smi n Cordyceps based on 5.8S rD N A and ITS2 sequences［J］.M ycosyst em a，2000，19(4):492-497.

［3］ 梁宗琦，韩燕峰，梁建东，等.冬虫夏草研究中几个值得关注的问题［J］.微生物学通报，2010，37(11):1692-1697.

［4］ 李雪芹，包天桐，王雁.比色法测定冬虫夏草中甘露醇的含量［J］.中草药，1999，30(1)19-21.

［5］ 温鲁，尹起范，唐玉玲，等.蚕虫草与有关虫草活性成分检测比较［J］.食品科学，2004，25(8):155-157.

［6］ 陈林琤，许瑞祥，郭嘉信.高效液相色谱与液相色谱-质谱分析冬虫夏草相关产品之麦角固醇与其衍生物［J］.分析化学，2011，39(9):1380-1386.

［7］ 刘彦威，刘娜，刘利强.冬虫夏草有效成分的研究进展［J］.动物医学进展，2004，25(3):51-53.

［8］ 夏春雨，孙巍，刘学铭.虫草有效成分的研究进展［J］.中国食用菌，2009，28(2):3-7.

［9］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京:中国医药科技出版社，2010：377-378．

［10］H ol l i day JC，Cl eaver P，Loom i s P M，et al.A nal ysi s of qual i t y and t echni ques for hybri di zat i on of m edi ci nal fungus Cordyceps si nensi s(Berk.)Sacc.(A scom ycet es)［J］.Int.J.M ed.M ushroom s，2004，26(6):151-164.

［11］Li SP，Y ang FQ，Tsi m K arl WK.Q ual i t y cont rol of Cordyceps si nensi s，a val ued t radi t i onal Chi nese m edi ci ne［J］.J Pharm aceut Bi om ed，2006，41:1571-1584.

［12］Li SP，Li P，Lai CM，et al.Si m ul t aneous det erm i nat i on of ergost erol，nucl eosi des and t hei r bases from nat ural and cul t ured Cordyceps by pressuri zed l i qui d ext ract i on and hi gh-perform ance l i qui d chrem at agraphy［J］.J Chrom at ogr A，2004，1036:239-243.

［13］G uo FQ，LiA，H uang LF，etal.Ident i fi cat i on and det erm i nat i on ofnucl eosi desi n cordycepssi nensi s and i t s subst i t ut es by hi gh perform ance l i qui d chrom at ography w i t h m ass spect rom et ri c det ect i on［J］.J Pharm Bi om ed A nal，2006，40(3):623-630.

Study of Quality Characteristics of DongChong XiaCao from Different Origins in Gansu Province

KANG Hongmei1,LI Huahua1,GU Chunhua2,MU Tingting3,SU Chang1
1 Gansu Provincial Academy of Sciences Institute of Biology,Lanzhou 730000,China;
2 Gansu Province Product Quality Supervision and Inspection Center;
3 Gansu University of Chinese Medicine

Objective:To study the quality characteristics of DongChong XiaCao[Cordyceps sinensis(berk)sacc] from different origins in Gansu province.Methods:Based on DongChong XiaCao from Gansu province(Tianzhu, Jishishan,Maqu,Gahai and Xiahe)and Qinghai province (Tongren),HPLC and colorimetry methods were used to determine the active components content of main.Results:DongChong XiaCao from Gansu province are smaller [(0.1044±0.005)～(0.1904±0.009)g/plant].There are no significant content differences of adenosine and mannitol in DongChong XiaCao from different origins,and the contents respectively are(0.320±0.088)～(0.613±0.076)mg/g and (1.66±0.09)～(2.23±0.07)mg/g;the differences of the purine content are significant,and the content is higher in Jishishan and Maqu;the highest content of polysaccharides in DongChong XiaCao are the samples from Tianzhu and Jishishan,and the lowest content is from Tongren;the highest content of ergosterin is the sample from Tongren,but there are no significant differences from the samples from Tianzhu and Xiahe.Conclusion:The different DongChong XiaCao from Gansu province are smaller,there are no big differences of the main content of active components from DongChong XiaCao whose origin is Qinghai province,and they are of high qualities.

DongChong XiaCao;active components;quality;HPLC;Gansu

R282.6

A

1004-6852(2016)08-0011-04

2015-12-04

甘肃省自然科学基金计划项目(编号1107RJZA 113)。

康红梅(1973—)，女，博士学位，副研究员。研究方向：区域特色资源开发和利用。