正交试验法优选黄马酊最佳渗漉工艺

陈 薇，冷 静，杨 敏，高 倩，王 琴

（1.重庆市中医院，重庆 400021； 2.重庆医科大学药学院，重庆 400042）

正交试验法优选黄马酊最佳渗漉工艺

陈 薇1，冷 静1，杨 敏1，高 倩2，王 琴1

（1.重庆市中医院，重庆 400021； 2.重庆医科大学药学院，重庆 400042）

目的 优选黄马酊的最佳渗漉提取工艺。方法 选择乙醇浓度（A）、乙醇用量（B）及渗漉速度（C）3个因素为考察对象，以士的宁及盐酸小檗碱的含量为综合评价指标，采用 L9（34）正交试验进行优选。结果 以70%乙醇10倍量进行渗漉，渗漉速度为3 mL／（min·kg）为最佳工艺条件。结论 优选得到的黄马酊渗漉工艺合理可行，可用于制剂室大生产。

黄马酊；小檗碱；士的宁；渗漉；正交试验

Chen Wei1,Leng Jing1,Yang Min1,Gao Qian2,Wang Qin1

(1.Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital,Chongqing,China 400021;

2.The Pharmacy College of Chongqing Medical University,Chongqing,China 400042)

黄马酊是重庆市中医院使用多年的临床验方，具有疏通经络、活血止痛、解毒消肿、消瘀散结之功效，临床主要外用于血管栓塞性脉管炎（中医脱疽），有独特疗效。黄马酊由酒黄连和制马钱子2味中药材组方，其中黄连主要指标成分为盐酸小檗碱[1]285，马钱子主要指标成分为士的宁[1]48，均为生物碱类，其醇溶性较水溶性好[2－3]，因此提取溶剂选用一定浓度的乙醇。常用的乙醇提取方法有浸渍法、渗漉法、回流法等，渗漉法有操作简便、效率高等优点，适于医院制剂室生产。为了保证制剂的质量和疗效，本研究中以盐酸小檗碱及士的宁的含量为评价指标[4]，采用正交试验方法，对乙醇最佳渗漉工艺进行了考察。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

安捷伦 1260型高效液相色谱仪(安捷伦公司)；ODS－3 C18柱（北京迪马欧泰科技发展中心）；DAD紫外检测器；自制渗漉装置；分析电子天秤（瑞士Mettler Toledo仪器公司）；Milli－Q Biocel A－10超纯水制备系统（美国Millipore公司）。

1.2 试药

黄连对照药材（批号为913－8902），马钱子对照药材（批号为 121164－200302），士的宁对照品（批号为110705－200306，供含量测定用，含量以97%计），盐酸小檗碱对照品（批号为110713－200609，供含量测定用，含量以98.5%计），以上试药均由中国药品生物制品检定所提供；水为超纯水，甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：ODS－3C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇－乙腈－0.1 mol／L磷酸二氢钠及0.025 mol／L十二烷基硫酸钠溶液（50∶25∶25）；检测波长：254 nm；柱温：30℃；流速：1.0 mL／min。理论板数以士的宁峰计应不低于5 000。

2.1.2 溶液制备

称取士的宁和盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含士的宁0.046 mg及盐酸小檗碱0.097 mg的对照品混合溶液，即得对照品溶液。取处方比例的黄连粗粉、马钱子粗粉，加相应浓度的乙醇润湿，置渗滤桶中，浸渍48 h，调节流速，加乙醇至处方量，收集渗滤液，静置，滤过，精密量取1 mL滤液，置100 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得供试品溶液。取缺黄连阴性样品、缺马钱子阴性样品，同供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.1.3 方法学考察

系统适用性试验：在拟订色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL注入液相色谱仪，测定。各峰之间分离度均大于1.5。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图

标准曲线绘制：称取士的宁对照品14 mg，盐酸小檗碱对照品24 mg，精密称定，分别置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，再分别精密量取上述2种对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。精密吸取上述系列对照品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定士的宁及盐酸小檗碱的峰面积。以进样量(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程。士的宁为Y＝2 563.9 X－18.393，R2＝0.999 4(n＝6)，士的宁进样量在0.056～0.336 μg范围内与峰面积线性关系良好；盐酸小檗碱为 Y＝3 353.4 X－20.588，R2＝0.999 5 (n＝6)，盐酸小檗碱进样量在0.096～0.576 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取同一对照品溶液，重复进样5次。结果士的宁峰面积的 RSD为0.6%(n＝5)，盐酸小檗碱峰面积的 RSD为0.8%(n＝5)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0，1，2，4，6，8，10 h时在拟定色谱条件下进样检测。结果士的宁峰面积的 RSD为 1.2%(n＝7)，盐酸小檗碱峰面积的RSD为1.4%(n＝7)，表明供试品溶液在10 h内稳定。

重复性试验：取同一批样品5份，精密量取，依法制备5份供试品溶液，进样测定。结果士的宁峰面积的RSD为 1.3%(n＝5)，盐酸小檗碱峰面积的 RSD为1.6%(n＝5)，表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取已知含量（盐酸小檗碱2.0 g／L，士的宁0.91 g／L）的样品0.5 mL，置100 mL容量瓶中，再分别加入8，10，12 mL盐酸小檗碱、士的宁对照品溶液（盐酸小檗碱0.097 g／L，士的宁0.046 g／L），按拟订方法测定含量，计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果(n＝9)

2.2 黄马酊渗漉工艺优化

2.2.1 正交试验结果

按处方比例称取黄连粗粉、马钱子粗粉，按2.1.2项下方法制备供试品溶液。以士的宁及盐酸小檗碱的含量为综合评价指标，对黄马酊渗漉工艺进行优化。根据预试验考察结果，选择乙醇浓度（因素A），乙醇用量（因素B）及渗漉速度（因素C）3个因素，各取3个水平进行正交试验。因素水平表及试验结果见表2至表4。

2.2.2 结果分析

正交试验结果表明，乙醇渗漉的影响因素为乙醇用量＞乙醇浓度＞渗漉速度，且以B2A2C3为最佳。方差分析结果表明，因素B有显著影响，各因素影响大小顺序为B＞A＞C，A和C无显著影响，考虑到渗漉速度为1 mL／min（以1 kg药材计），生产周期过长，故将因素C降低一个水平，即C2。故最佳工艺条件为A2B2C2，即以70%乙醇10倍量进行渗漉，渗漉速度为3mL／（min·kg）。

表2 因素水平表

2.2.3 验证试验

根据正交试验优化所得最佳渗漉工艺条件，同法重复3次提取，所得士的宁及盐酸小檗碱的含量结果见表5。结果表明，优化所得渗漉工艺条件合理可行、稳定可靠，具有可操作性和重复性。根据酒黄连药材中盐酸小檗碱含量为6.4%，制马钱子药材中士的宁含量为1.34%，可计算出黄连的提取转移率为80.82%，制马钱子的提取转移率为82.34%。

表3 L9(34)正交试验结果

表4 方差分析表

表5 最佳渗漉工艺验证试验结果

3 讨论

黄马酊作为医院的传统中药制剂，在四肢血管科、内分泌科、皮肤科有着广泛的应用，对糖尿病足溃疡[5]、血管栓塞性脉管炎、肢端缺血坏死[6]、下肢慢性溃疡[7]等具有良好的临床效果，备受广大患者青睐。

黄马酊传统制法为白酒浸泡，本研究采用乙醇为溶剂，采用正交试验对酒黄连、制马钱子制成的黄马酊的提取方式进行优选，结果表明，以70%乙醇10倍量进行渗漉，渗漉速度为3 mL／(min·kg)，所得酊剂中士的宁及盐酸小檗碱的含量较传统的冷浸法高，略低于回流法所得含量。对于院内制剂，回流法不适于大生产，故选用渗漉法。

黄马酊的传统提取方法为白酒浸泡30 d，本研究对提取方法优选后3～4 d即可完成批量生产，明显缩短了制剂所需时间，对于规范黄马酊的制作工艺、指导医院制剂生产具有一定意义。

黄马酊属于复方制剂，已知有效成分为盐酸小檗碱、士的宁，是否还有其他成分存在，可否进一步浓缩提纯，或开发其他更适用的剂型，值得进一步研究。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010.

[2]段晓颖.正交试验法优选马钱子醇提工艺研究[J].中国现代应用药学，2007，24(5):375－377.

[3]徐 媛，张 琰，刘新友，等.正交试验法优选黄连中小檗碱提取工艺[J].中国中医药信息杂志，2011，18(5):60－62.

[4]陈 玲，敖 利.RP－HPLC测定通络解毒凝胶剂中士的宁和盐酸小檗碱的含量[J].中国中医急症，2012，21（8）:1 259－1 268.

[5]陈德清，朱丹平，邱子津，等.超声清创术联合黄马酊治疗糖尿病足溃疡的临床观察[J].中国药房，2015，27(26):3 660－3 662.

[6]张嗣兰，黄建平，裴 玉，等.黄马酒治疗肢端缺血坏死、慢性溃疡及实验研究[J].中国中医急症，1997（1）:44－46.

[7]郭东梅.黄马酊换药治疗下肢慢性溃疡的护理干预及疗效观察[J].湖北中医杂志，2012，20(9):30－31.

Optimum Percolation Extraction Process of Huang－Ma Tincture by Orthogonal Test Method

Objective To optimize the percolation extraction process of Huang－Ma Tincture.Methods The Ethanol concentration(A), Ethanol dosage(B)and percolation rate(C)were selected as the factors,and the contents of Strychnine and Berberine Hydrochloride were taken as the observed index;L9(34)orthogonal test was designed to optimize the process.Results The optimal technology was 70% ethanol 10 times as much as that of the drugs and percolation rate was 3 mL／(min·kg).Conclusion The preparation process is reasonable and highly efficient,which can be used for he mass production of Huang－Ma Tincture.

Huang－Ma Tincture;strychnine;berberine hydrochloride;percolation;orthogonal Test

R284.2；R282.71；TQ461

A

1006－4931(2016)21－0037－03

陈薇（1981－），女，硕士研究生，主管中药师，主要从事方剂学研究，（电子信箱）1016487073＠qq.com；杨敏（1969－），男，大学本科，主任中药师，主要从事医院药学管理研究，本文通讯作者，（电子信箱）453475345＠qq.com。

2016－05－18)