半滑舌鳎鳃黏液免疫相关酶活性对黄芪多糖的免疫应答

刘金海，罗小丽，管 健，黄 辉，陈 恒

( 1.集美大学 水产学院，福建 厦门 361021； 2.集美大学 水生生物技术研究所，福建 厦门 361021； 3.鳗鱼现代产业技术教育部工程研究中心，福建 厦门 361021 )

半滑舌鳎鳃黏液免疫相关酶活性对黄芪多糖的免疫应答

刘金海1,2,3，罗小丽1，管 健1，黄 辉1，陈 恒1

( 1.集美大学 水产学院，福建 厦门 361021； 2.集美大学 水生生物技术研究所，福建 厦门 361021； 3.鳗鱼现代产业技术教育部工程研究中心，福建 厦门 361021 )

在水温25 ℃下，给体质量(5.8±1.5) g的半滑舌鳎投喂在基础饲料中添加0、300、600、900、1200、1500 mg/kg 和 1800 mg/kg黄芪多糖的饲料后，每隔18 d检测半滑舌鳎鳃黏液溶菌酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性，以检测半滑舌鳎鳃黏液对黄芪多糖的免疫应答及较佳剂量。90 d的免疫结果显示，半滑舌鳎鳃黏液溶菌酶、过氧化物酶和碱性磷酸酶活性先增强后降低；半滑舌鳎鳃黏液酸性磷酸酶活性对低剂量(300～600 mg/kg)和中高剂量(1200～1800 mg/kg)黄芪多糖的免疫应答，随试验时间延长，分别呈增强及先增强后减弱的变化趋势。试验结束时，中低剂量(600～900 mg/kg)黄芪多糖组半滑舌鳎鳃黏液溶菌酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性均极显著高于对照组(P< 0.01)。从成本、高非特异免疫活性的角度看，半滑舌鳎配合饵料中黄芪多糖较佳添加剂量为600 mg/kg。

黄芪多糖；溶菌酶；过氧化物酶；碱性磷酸酶；酸性磷酸酶

半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)主要分布于我国的黄、渤海海域[1-2]，生长快、经济价值高，为名贵暖温性底栖大型海水养殖鱼类[3-4]。近年来，随着我国水产养殖规模化和集约化不断提高，养殖病害日益严重，采用抗生素和其他化学药物来控制时，滥用和误用渔药会污染和恶化环境，威胁了人类的健康和安全。寻求无公害渔药和新型免疫增强剂已成为水产养殖中的研究热点。中草药为“绿色渔药”，具有来源广泛、价廉效优、无毒副作用等优点。黄芪多糖是从来源丰富的黄芪根部分离出的多糖组分，具有广泛的免疫增强和抗病毒作用，可作为一种新型的免疫增强剂，已在畜禽中广泛应用[5]，但在水产养殖中的应用还较少。本试验在半滑舌鳎基础饵料中分别添加6个不同水平的黄芪多糖，分析了其鳃黏液中溶菌酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性，探讨了黄芪多糖对半滑舌鳎鳃黏液免疫力的作用效果，为黄芪多糖在半滑舌鳎养殖中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

半滑舌鳎体质量(5.8±1.5) g，来源于福建省东山县水产养殖场。

1.2 方法

采用单因素6水平3重复的试验方法。第1组为对照组，其他6组为试验组，各试验组设3个重复，每个重复15尾鱼。养殖于循环水过滤系统控制的养殖桶中，每桶容积为1.14 m3，控制养殖水体约1 m3，养殖密度为15尾鱼/m3，盐度为28±1。使用加热棒控制水体温度为(25±1) ℃，溶解氧>5 mg/L。暂养期间投喂基础饵料；免疫试验期间，对照组投喂基础饵料，试验组投喂免疫饵料。每日于18:00和22:00投喂，1 h后吸掉残饵。

基础饲料配方见表1。先将鱼粉、沙蚕粉、豆粉、淀粉、矿物盐、酵母粉和预混料等粉状成分按所需用量混合均匀，再将搅碎的牡蛎肉、鱼油与粉状料混匀，制粒备用。在基础饵料中，添加不同剂量(300、600、900、1200、1500 mg/kg和1800 mg/kg)的黄芪多糖，配制成6种试验饲料。免疫试验后，每隔18 d检测1次，半滑舌鳎鳃黏液溶菌酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性，试验周期为90 d，共测5次。

试验饲料配方见表2。将基础饲料制成粉状后，与黄芪多糖及面粉混匀，之后将血红虫、鸡蛋和水用豆浆机打碎混匀，最后将上述粉料和液料混合均匀，至饲料用手揉起可成团状且不撒为宜。用制粒机将调和好的试验饲料制成2号颗粒，于烘箱中40 ℃烘干备用。

表1 试验用基础饲料配方(每100 g含量)

表2 试验饲料的配方(每100 g含量)

注：对照组投喂基础饵料，1～6组投喂试验饲料.

1.3 鳃黏液的采集方法

将鱼鳃取出，用清洗干净并消毒后的干纱布将其上的水及血吸干，之后将其置入10 mL玻璃离心管中加入5 mL蒸馏水，超声震荡20 min，取出鱼鳃，保留含有黏液的溶液备用。

1.4 鳃黏液免疫相关酶活性的测定

1.4.1 溶菌酶活性的测定

溶菌酶活性参照刘金海等[6]方法测定。把一支CGMCC编号为1.0634的溶壁微球菌冻干粉从冰箱中取出并消毒。用移液枪吸取0.3～0.5 mL适宜的液体培养基滴入安瓿管中，轻轻振荡，使冻干菌体溶解成悬浊液，吸取全部菌体悬浊液，接种于3支试管斜面培养基上，放入28 ℃恒温培养箱中培养。再以活化细菌为菌种，进行扩大培养，以后每3 d重新接种一次，确保菌种处于增长期状态，试验前24 h，再培养试用菌。

溶壁微球菌培养使用002营养肉汁琼脂培养基。

1.4.2 过氧化物酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性的测定

3种酶活性参照南京建成生物技术研究所提供的试剂盒和方法进行测定。

1.5 数据处理

采用Excel和SPSS 17.0软件进行数据处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 半滑舌鳎鳃黏液溶菌酶活性对黄芪多糖的免疫应答

随试验时间延长，半滑舌鳎鳃黏液溶菌酶活性呈先增后减的变化趋势(表3)。18～72 d，试验组半滑舌鳎鳃黏液溶菌酶的活性均极显著高于对照组(P<0.01)。试验结束时，添加黄芪多糖300～900 mg/kg试验组半滑舌鳎鳃黏液溶菌酶活性均极显著高于对照组(P<0.01)，添加黄芪多糖1500～1800 mg/kg试验组鱼鳃黏液溶菌酶活性显著低于对照组(P<0.05)，添加黄芪多糖1200 mg/kg试验组与对照组无显著差异(P>0.05)。半滑舌鳎鳃黏液溶菌酶活性随黄芪多糖添加剂量增高，较早达到较高水平，之后便逐渐下降。试验结束时,600 mg/kg试验组的作用效果最好。

2.2 半滑舌鳎鳃黏液过氧化物酶活性对黄芪多糖的免疫应答

随着试验时间延长，半滑舌鳎鳃黏液过氧化物酶活性呈先增后减的变化趋势，18 d后，半滑舌鳎鳃黏液过氧化物酶活性均极显著或显著高于对照组(P<0.01或P<0.05)(表4)。试验中半滑舌鳎鳃黏液过氧化物酶活性随黄芪多糖添加剂量增高，较早达到较高水平，之后便逐渐下降。试验结束时，各试验组半滑舌鳎鳃黏液过氧化物酶活性均极显著或显著高于对照组(P<0.01或P<0.05)，尤以添加黄芪多糖600 mg/kg试验组的作用效果最好。

表3 试验不同时间各组半滑舌鳎鳃黏液溶菌酶活性 IU

注：同列中2个小写字母相同的平均值间差异不显著，1个不同差异显著，2个都不同差异极显著。同行中2个大写字母相同的平均值间差异不显著，1个不同差异显著，2个都不同差异极显著.下同.

表4 试验不同时间各组半滑舌鳎鳃黏液过氧化物酶活性 IU

2.3 半滑舌鳎鳃黏液碱性磷酸酶活性对黄芪多糖的免疫应答

除300 mg/kg试验组外，各试验组半滑舌鳎鳃黏液碱性磷酸酶活性，随时间延长均呈先增后减的变化趋势；随黄芪多糖添加剂量增高，半滑舌鳎鳃黏液碱性磷酸酶活性较早达到较高水平，之后便逐渐下降。试验结束时，300～1500 mg/kg试验组半滑舌鳎鳃黏液碱性磷酸酶活性均显著高于对照组(P<0.05)，其中，尤以600 mg/kg试验组作用效果较好，1800 mg/kg试验组半滑舌鳎鳃黏液碱性磷酸酶活性与对照组无显著差异(P>0.05)。

2.4 半滑舌鳎鳃黏液酸性磷酸酶活性对黄芪多糖的免疫应答

300～600 mg/kg试验组半滑舌鳎鳃黏液酸性磷酸酶活性，随时间延长逐渐增强，36 d后极显著高于对照组(P<0.01)；其余各组半滑舌鳎鳃黏液酸性磷酸酶活性，随时间延长呈先增后减趋势(表6)。试验中半滑舌鳎鳃黏液酸性磷酸酶活性随黄芪多糖添加剂量增高，较早达到较高水平，随后逐渐降低。试验结束时，各试验组半滑舌鳎鳃黏液酸性磷酸酶活性均极显著高于对照组(P<0.01)；尤以900 mg/kg试验组作用效果较好。

表5 不同试验时间各组半滑舌鳎鳃黏液碱性磷酸酶活性 IU

表6 不同试验时间各组半滑舌鳎鳃黏液酸性磷酸酶活性 IU

3 讨 论

3.1 黄芪多糖对半滑舌鳎鳃黏液溶菌酶活性的影响

溶菌酶是吞噬细胞杀菌的物质基础，是动物机体许多组织重要的非特异性免疫因子和衡量非特异性免疫力的重要指标。李义等[7]在基础饲料中添加黄芪、党参、大黄等中草药制成的药饵，显著提了罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)血细胞吞噬活性、血清溶菌酶活力及酚氧化酶活力。袁吕江等[8]发现，鱼腥草素同系物能够提高小鼠血清溶菌酶活力，且随浓度增加增幅加大；体外试验发现，低浓度的鱼腥草素同系物可以明显提高溶菌酶的活性，随添加剂量的增加而抑制溶菌酶活性。本研究发现，600 mg/kg试验组和900 mg/kg试验组半滑舌鳎鳃黏液溶菌酶活性均在54 d时达最大值，极显著高于对照组(P<0.01)，之后虽降低，但仍极显著高于对照组(P<0.01)；试验结束时，黄芪多糖对半滑舌鳎鳃黏液溶菌酶活性的影响表现为300～900 mg/kg试验组极显著高于对照组(P<0.01)，1200 mg/kg试验组与对照组无显著差异(P>0.05)，1500～1800 mg/kg试验组则显著低于对照组(P<0.05)。这与李义等[7-8]的试验结果基本一致。

3.2 黄芪多糖对半滑舌鳎鳃黏液过氧化物酶活性的影响

过氧化物酶普遍存在于真核生物的各类细胞中，与生物的非特异免疫功能水平有一定程度的关联。赵娜等[9]发现，牙鲆(Paralichthysolivaceus)经海豚链球菌(Streptococcusiniae)3种免疫原免疫42 d后，血清中过氧化物酶活力先升高，第28 d起开始下降。顾华杰等[10]研究表明，灰树花多糖使吉富罗非鱼(GIFT,Oreochromisniloticus)血清和肝脏中过氧化物酶活性显著提高，且表现出明显的剂量效应，其促进作用随时间延长逐渐减弱。本研究与赵娜等[9-10]的研究结果相一致，即半滑舌鳎鳃黏液过氧化物酶活性先升高后逐渐降低，但各试验组过氧化物酶活性均显著或极显著高于对照组(P<0.05或P<0.01)。

3.3 黄芪多糖对半滑舌鳎鳃黏液碱性磷酸酶活性的影响

碱性磷酸酶广泛分布于人体及动物体的肝脏、骨骼、肠、肾等组织，经肝脏向胆外排出。这种酶与人及动物的免疫有关。王维新[11]对仿刺参(Apostichopusjaponicus)内脏组织的免疫酶活性进行了24 d的研究表明，仿刺参内脏组织碱性磷酸酶活性在第14 d时达到最高，随后逐渐降低。松浦镜鲤(Cyprinusspecularis)幼鱼血清碱性磷酸酶活性随饲料中维生素D3添加量的增加而先升后降，饲料中维生素D3达800 IU/kg时，碱性磷酸酶活性最高[16]。本研究发现，半滑舌鳎鳃黏液碱性磷酸酶活性随试验时间延长呈现先增后降的变化趋势，试验结束时，除1800 mg/kg组外，各试验组半滑舌鳎鳃黏液碱性磷酸酶活性均显著高于对照组(P<0.05)。但黄芪多糖添加剂量越高，半滑舌鳎鳃黏液碱性磷酸酶活性达到最大值的时间越短，随着试验时间的延长，碱性磷酸酶活性变化与黄芪多糖添加剂量无明显相关。

3.4 黄芪多糖对半滑舌鳎鳃黏液酸性磷酸酶活性的影响

酸性磷酸酶主要存在于动物的巨噬细胞，定位于溶酶体内，是一种在酸性条件下催化磷酸单酯水解生成无机磷酸的水解酶。水产动物酸性磷酸酶的理化性质、结构、功能及催化机理已作了大量的研究[13]。如草鱼(Ctenopharyngodonidellus)血清酸性磷酸酶活性随饲料中牛膝多糖添加剂量的增加而增加，至0.20%后，则呈缓慢下降[14]。本研究发现，在低剂量黄芪多糖(300～600 mg/kg)作用下，半滑舌鳎鳃黏液酸性磷酸酶活性随时间延长而逐步增强；在中高剂量黄芪多糖(900～1200 mg/kg、1500～1800 mg/kg)作用下，则呈先增后减的变化趋势；试验结束时，各试验组半滑舌鳎鳃黏液酸性磷酸酶活性均极显著高于对照组(P<0.01)。这与王红权等[14]研究高剂量的牛膝多糖使草鱼血清酸性磷酸酶活性下降但不抑制其活性的结果相一致。

4 小 结

(1)低剂量的黄芪多糖使半滑舌鳎鳃黏液溶菌酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性逐渐增强，对溶菌酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶活性具有先增强后抑制的作用；中高剂量的黄芪多糖对溶菌酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性均具有先增强后抑制的作用。

(2)半滑舌鳎鳃黏液中溶菌酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶活性对黄芪多糖的应答时序有所不同，第18 d时，1500 mg/kg试验组半滑舌鳎鳃黏液碱性磷酸酶的活性升至最高，之后降低；36 d时，900 mg/kg试验组半滑舌鳎鳃黏液溶菌酶和过氧化物酶活性达到最强，随后降低；至72 d时，900 mg/kg试验组半滑舌鳎鳃黏液酸性磷酸酶活性最强，随后降低；

(3)从成本及提高半滑舌鳎鳃黏液免疫活性的角度出发，建议在饲料中添加 600 mg/kg 黄芪多糖较佳。

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ImmuneResponseofActivityofEnzymesRelatedtoImmunitytoAstragalusPolysaccharidesinGillMucusofSemi-smoothSoleCynoglossussemilaevis

LIU Jinhai1,2,3,LUO Xiaoli1, GUAN Jian1, HUANG Hui1,CHEN Heng1

( 1.Fisheries College，Jimei University, Xiamen 361021, China；2. Aquatic Biotechnology Research Institute，Jimei University, Xiamen 361021, China；3. Engineering Research Center of the Modern Industry Technology for Eel, Ministry of Education, Xiamen 361021, China )

Juvenile semi-smooth sole (Cynoglossussemilaevis) with body weight of (5.8±1.5) g was fed basic diet supplemented with astragalus polysaccharides (APS) at a dose of 0, 300, 600, 900, 1200, 1500 and 1800 mg/kg diet with triplication at water temperature of 25 ℃ for 90 d, and the activities of lysozyme (LSZ), peroxidase (POD), alkaline phosphatase (AKP) and acid phosphatase (ACP) in the gill mucus were detected in the sole fed the diets containing various doses of APS in a 18 day interval to investigate the immune response of activities of LSZ, POD, AKP and ACP in the gill mucus to APS and further explore the optimal dietary dose of APS. The activities of LSZ, POD and AKP were found to be first increased and then decreased in the gill mucus. The activity of ACP was shown to be elevated with elapse of APS immunity in the low dose of APS groups (300—600 mg/kg), and to be increased first and then decreased in the middle and high levels of APS groups (1200—1800 mg/kg). At the end of the experiment, there were very significantly higher activities of LSZ, POD, AKP and ACP in the gill mucus in the low and middle dose APS groups (600—900 mg/kg) than those in the control group (P<0.01). It is recommended that the optimal dietary dose of APS be 600 mg/kg diet for semi-smooth sole juveniles based on feed cost and immune efficiency.

astragalus polysaccharide; lysozyme; peroxidase; alkaline phosphatase; acid phosphatase

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.02.003

S942.1

A

1003-1111(2016)02-0111-06

2015-03-25；

2015-10-15.

福建省自然科学基金资助项目(2012J01138).

刘金海(1965-)，男，副教授；研究方向：鱼类营养和免疫.E-mail：hnd530@126.com.