猪圆环病毒2型乌鲁木齐分离株全基因序列遗传变异分析

2016-12-20蔡扩军李爱巧何生杨启元徐敏杨小亮王涛

养猪 2016年5期

关键词：核苷酸乌鲁木齐圆环

蔡扩军，李爱巧，何生，杨启元，徐敏，杨小亮，王涛

（1.乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心，新疆乌鲁木齐830063；2.乌鲁木齐市米东区畜牧兽医站，乌鲁木齐831400）

猪圆环病毒2型乌鲁木齐分离株全基因序列遗传变异分析

蔡扩军1，李爱巧1，何生2，杨启元1，徐敏1，杨小亮1，王涛1

（1.乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心，新疆乌鲁木齐830063；2.乌鲁木齐市米东区畜牧兽医站，乌鲁木齐831400）

为分析乌鲁木齐市猪圆环病毒2型（PCV2）遗传变异情况，对疑似感染PCV2组织样品的全基因组进行PCR扩增、克隆和测序，并进行序列比对与遗传进化分析。结果表明，测序的5株PCV2基因组3株全长为1 766 bp，2株全长为1 767 bp，5株PCV2核苷酸序列同源性在96.1%～99.5%之间，与GenBank国内外已发表的17株PCV2基因核苷酸序列同源性在94.5%～99.7%之间；遗传进化树显示，3株属于新出现的PCV2d亚型毒株，2株属于国内优势流行的PCV2b亚型毒株。

猪圆环病毒2型；遗传变异；分析

猪圆环病毒病是由猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）引起的猪的一种传染病，可引起一系列相关的临诊病症，其中包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、皮炎肾病综合征、母猪繁殖障碍等，还可能与增生性肠炎、坏死性间质性肺炎、仔猪先天性震颤等有关[1]。其临床表现多种多样，主要特征为体质下降、消瘦、贫血、黄疸、生长发育不良、腹泻、呼吸困难、母猪繁殖障碍、内脏器官及皮肤的广泛病理变化，特别是肾脏、脾脏及全身淋巴结的高度肿大、出血和坏死。PCV2主要侵害机体的免疫系统，该病可导致猪群产生严重的免疫抑制，从而容易继发或并发其他疾病[2]。自1997年加拿大首次报道以来，该病已遍及世界各养猪国家和地区[3]。我国于1999年首次发现，目前该病已在我国猪群中广泛流行，给养猪业造成了很大的经济损失，并引起了高度关注[4-5]。

PCV2为圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属成员，病毒粒子为二十面体对称结构，含有单股负链环状DNA，基因组全长为1 767 bp或1 768 bp，含有11个阅读框[6-7]。而近年来不断有PVC2基因组为1 766 bp新毒株的文献报道[7-8]，该病毒的基因组不断地发生变异，造成的危害日益严重[9]。鉴于此，本文通过对乌鲁木齐市PCV2流行毒株的全基因组序列进行测序，并跟国内外代表毒株进行比对分析，对流行毒株的变异规律和分子流行病学特征进行探究和分析，以期为本地区PCV2防治提供必要的分子流行病学信息。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2016年3月15日至4月20日在新疆乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心进行。

1.2 病料样品

疑似感染PCV2猪的肺脏、淋巴结、扁桃体等组织病料。

1.3 主要试剂

病毒核酸纯化试剂盒、Premix Taq（TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye）购自TaKaRa公司。

1.4 引物设计

上游引物：5'-CCCGTTGGAATGGTACTCCTCAA CTG-3'；下游引物：5'-CGGGGTCTGATTGCTGGTAA TCAGAAT-3'。预计扩增目的片段大小1766~1768bp。

1.5 全基因组的扩增与测序

按照病毒核酸纯化试剂盒说明书提取PCV2阳性样品的DNA。按照Premix Taq说明书对提取的DNA进行PCR扩增，反应体系50 μL：Premix Taq 25 μL；上下游Primer（25 μmol/L）各1 μL；Template DNA 2 μL；RNase Free ddH2O添加至50 μL。反应程序为：94℃30 s、56℃30 s、72℃2 min，32个循环；72℃10 min，取10 μL PCR产物进行凝胶电泳，并选择符合目的条带大小、条带单一且明亮的PCR阳性产物送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。

1.6 基因序列遗传进化分析

应用生物学分析软件GenBank Blast和DNAStar对扩增的核苷酸序列与GenBank中登录的PCV2全基因序列进行同源性比较，利用Mega 5.0软件，NJ法构建系统进化树（boot strap值为1 000循环）。

2 结果

2.1 目的基因的扩增结果

用RT-PCR法从9份疑似感染PCV2的样品中扩增出7份与预期片段大小相符的特异性片段，2份可疑样品，扩增结果见图1。

图1 PCV2全基因PCR扩增电泳结果

2.2 目的基因的序列测定结果

送出测序的5株PCV2样品3株基因组全长1 766 bp，2株1 767 bp，登录NCBI利用Blast对测序结果进行分析，结果表明，扩增得到的5条序列为PCV2基因序列，分别命名为WLMQ-1株（1 766 bp）、WLMQ-2株（1 767 bp）、WLMQ-3株（1 767 bp）、WLMQ-4株（1 766 bp）、WLMQ-5株（1 766 bp）。

2.3 PCV2全基因组核苷酸同源性对比分析

5株PCV2全基因组核苷酸序列之间的同源性为96.1%～99.5%；与1010 PCV2a Canada、DBNSX07、DK1980 PCV-2cDenmark、PCV2 LG、PCV2 WuHan、PCV2-09CQ、PCV2-09HeN、PCV2-09HLJ、PCV2-HB、PCV2-QD、PCV2-SC、PCV2-SD、PCV2-SH、PCV2-SHZ、PCV2-SZ、PCV2b France、TJ PCV2d毒株核苷酸序列同源性分别为95.3%～96.2%、96.0%～99.5%、94.7%～95.4%、95.5%～95.8%、95.5%～95.8%、96.2%～99.7%、96.5%～98.8%、95.8%～99.4%、96.2%～99.2%、95.9%～99.5%、94.5%～95.5%、96.3%～98.0%、95.8%～99.4%、95.9%～99.5%、95.1%～95.8%、96.2%～99.7%、96.8%～98.4%。具体比对结果见图2。

图2 PCV2分离株全基因组核苷酸同源性比较

2.4 PCV2全基因序列遗传进化关系

将5株PCV2全基因序列与国内外已登录的17株PCV2全基因序列构建遗传进化树（图3），结果显示，WLMQ-1、WLMQ-5分离株与PCV2-09CQ、 PCV2-SHZ、TJ PCV2d同属于PCV2d亚型；WLMQ-2、WLMQ-3与PCV2b France、DBN-SX07同属于PCV2b亚型；5株分离株与PCV2a亚型亲缘关系较远，与PCV2c亚型亲缘关系最远。

图3 PCV2全基因序列遗传进化关系

3 讨论

PCV是迄今发现的一种最小的动物病毒[10]。目前已知的PCV有2个血清型，即PCV1和PCV2[11]。PCV1没有致病性，PCV2具有致病性。PCV2全基因组存在1 767 bp或1 768 bp两种不同的长度。本研究测序的5株毒株中3株序列长度为1 766 bp，属于变异毒株，提示该地区PCV2在分子水平上已经出现了的变异。这也在分子水平上阐明了在乌鲁木齐地区PCV2流行毒株的复杂性和多样性，而导致这一现象的原因可能与近年来新疆大力发展养猪业而从不同地区引进了隐性感染PCV2的种猪有一定关系。

最新的研究结果把PCV2分为了PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e等5种基因型亚群[12-13]，国内外PCV2分子流行病学的分析结果表明，PCV2基因型发生了由PCV2a到PCV2b的转换，我国PCV2存在的基因型有PCV2a、PCV2b、PCV2d，以PCV2b流行毒株为主，是造成PCV2流行的主要病因[7，14]。全基因组核苷酸同源性比较发现，5株乌鲁木齐PCV2分离株核苷酸序列同源性在96.1%～99.5%之间，与国内外已发表的17株PCV2基因核苷酸序列同源性也在94.5%～99.7%之间。从本次遗传进化树可以看出，乌鲁木齐地区的PCV2基因型3株为PCV2d亚型，2株为PCV2b亚型，据此推测乌鲁木齐地区PCV2的流行株情况可能与全国流行情况存在一定差异，PCV2d亚型可能逐步成为该地区PCV2流行毒株的优势基因型，这给本地区PCV2感染的防控带来了难度，应引起足够的重视。另外，遗传进化分析结果显示，乌鲁木齐地区正在使用的疫苗株DBN-SX07属于PVC2b亚型，只与5株病毒中的2株处在同一分支上，说明目前使用的疫苗可能与流行的毒株不是最佳匹配，其疫苗效果可能不是十分理想，需寻求更加合适的疫苗。

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