草甘膦胁迫对马唐抗氧化酶系及丙二醛含量的影响研究

 夏爱莲，金晨钟,2,3，胡一鸿,2,3，刘 宵，邹婷婷，王 艳,2,3 

（1.湖南人文科技学院农业与生物技术学院，湖南 娄底 417000；

2.湖南省农田杂草防控技术与应用协同创新中心，湖南 娄底 417000；3.农药无害化应用湖南省高校重点实验室，湖南 娄底 417000）

草甘膦胁迫对马唐抗氧化酶系及丙二醛含量的影响研究

夏爱莲1，金晨钟1,2,3，胡一鸿1,2,3，刘 宵1，邹婷婷1，王 艳1,2,3

（1.湖南人文科技学院农业与生物技术学院，湖南 娄底 417000；

2.湖南省农田杂草防控技术与应用协同创新中心，湖南 娄底 417000；3.农药无害化应用湖南省高校重点实验室，湖南 娄底 417000）

研究了在不同浓度草甘膦胁迫下，马唐（Digitaria sanguinalis L.）体内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等3种抗氧化酶活性及其丙二醛（MDA）含量随时间的变化情况。结果表明：马唐在草甘膦胁迫初期，3种酶活性和MDA含量较对照值有所提高；草甘膦处理6 d后，各指标均达到最高值；第9天后，各指标开始下降；至第12天后，450、900和1 800 g/hm2草甘膦处理马唐的SOD、POD、CAT活性及MDA含量均降至对照水平。这表明草甘膦对马唐的伤害在经过一定时间的生长发育后可恢复，说明马唐对草甘膦较易产生抗药性。

草甘膦；马唐；抗氧化酶系统；丙二醛

全球广泛分布的各种杂草已严重影响作物的产量和品质，极大危害了农业生产的发展。化学除草剂是防治杂草的主要方法，草甘膦理化性质稳定，具有低毒、低残留、高效、广谱、灭生性等优点，是目前全世界除草剂使用量最大的品种之一[1]。但随着草甘膦用量持续增加，选择压也在增加，抗草甘膦杂草也日益增多，到目前为止已经公布了28种杂草对草甘膦产生抗性[2]，抗草甘膦杂草问题日益严重，急需解决。马唐（Digitaria sanguinalis L.）属禾本科一年生草本植物，广布全国各地，是旱秋作物田地、果园、苗圃的恶性杂草，发生数量、分布范围在旱地杂草中均居首位，以作物生长的前中期危害为主[3]。近年来，在中国南方地区，许多旱秋作物田地及果园等使用草甘膦频繁，导致其对马唐的防除效果变差，给果园和农田管理带来极大不便。

据已有研究表明，杂草对草甘膦的抗性机制至少有3种：靶标酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）的改变、除草剂在植物体内的吸收和传导以及除草剂代谢速率的改变[4-5]。除草剂对植物产生毒害的过程中往往会诱导产生活性氧等自由基，有研究表明：喷施乐果可促使菠菜叶片中POD、CAT活性增强以及MDA含量明显增加[6]；不同时期草甘膦处理引起了铜绿微囊藻的氧化损伤，加药组的MDA含量显著增加[7]；不同浓度的草甘膦胁迫导致铁皇冠叶片SOD、CAT、POD活性提高，MDA含量逐渐增加[8]。

据湖南地区农业技术推广机构和农民反映，草甘膦在防除旱秋作物田地、田埂、果园的马唐时用量加大、效果变差，但目前国内外尚未见有关马唐对草甘膦抗性的研究报道。因此，试验以马唐的叶片为材料，从植物生理生化角度研究马唐的抗氧化酶活性、脂质过氧化反应与马唐抗药性之间的关系，旨在为我国抗草甘膦杂草研究和马唐等抗性杂草的防除提供理论依据，提高人们对抗药性植物的认识。

1　材料与方法

1.1试验材料与仪器

供试马唐种子于2015年9月在娄底市思塘村的彩色水泥厂对面菜地采集，种子经自然风干，3周后置于纸袋内室温存储备用。实验用土壤于湖南人文科技学院农业与生物技术学院实验楼下挖取，烘干后碾碎，与基质按1∶1混匀，移至花盆备用；草甘膦异丙胺胺盐（41%）购自于湖南娄底农科所农药实验厂；其他试剂均为国产分析纯。主要仪器为：赛多利斯电子天平、754紫外-可见光分光光度计及Conviron探入式植物生长箱。

1.2试验方法

1.2.1种子萌发 取若干马唐种子置于培养皿中的滤纸上，加入适量蒸馏水浸泡24 h，去掉蒸馏水后加入适量52 g/L KNO3浸泡48 h，用蒸馏水洗净后置入生长箱内培养萌发（白天：温度28℃，光照14.5 h，相对湿度65%；夜间：温度24℃，光照9.5 h，相对湿度55%）。待发芽后，移入事先装好土壤的花盆中。继续放入生长箱内培养。

1.2.2草甘膦处理 当马唐长至15～20叶期时，用手持压缩喷雾器给马唐均匀喷雾不同浓度的草甘膦，对水量为450 L/hm2。每个处理1桶，面积约0.2 m2，设置草甘膦为5个浓度梯度：有效成分分别为0、450、900（推荐剂量）、1 800和3 600 g/hm2。

1.2.3指标测定及方法 在草甘膦处理第3、6、9和12天后的上午，取草甘膦处理的马唐叶片于冰盒，迅速带回实验室，取0.1 g叶片，用0.8 mL PBS（0.2 mol/L，pH值7.8）研磨，定容到1 mL，在12 000 r/min的条件下离心15 min，所得上清液可用于SOD、POD、CAT活性、MDA含量的测定。

马唐叶片SOD活性测定采用氮蓝四唑光化还原法；POD活性测定采用愈创木酚法测定；CAT活性用分测定采用分光光度法；MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法[9-10]。各指标的测定重复3次，取其平均值。

1.2.4数据分析 采用SPSS 21.0软件进行统计显著性分析（ANOVA法）和作图。

2　结果与分析

2.1草甘膦胁迫对马唐叶片SOD活性的影响

由图1可知，随着不同浓度草甘膦处理马唐时间的延长，其马唐叶片SOD活性呈先升高后降低的趋势，且其SOD活性随草甘膦剂量的增加而增加，均在第6天达到最高。草甘膦处理后第3、6和9天，除了0和450 g/hm2处理的SOD活性无显著性差异外，其他各组均有显著性差异；处理第12天，除了1 800和3 600 g/hm2处理SOD活性显著高于对照外，其他各剂量之间无显著性差异，且各浓度草甘膦处理的SOD活性均有所下降，尤其450和900 g/hm2处理的SOD活性基本恢复至对照水平。这可能是由于马唐通过提高SOD活性来抵御草甘膦可能带来的氧化损伤，到胁迫后期低浓度（450～900 g/hm2）草甘膦处理马唐的SOD活性才恢复至对照水平。

图1　草甘膦胁迫对马唐叶片SOD活性的影响

2.2草甘膦胁迫对马唐叶片POD活性的影响

由图2可知，POD活性随着草甘膦胁迫时间的延长和剂量的增加而增加，第6天达到峰值，然后POD活性开始呈现下降趋势，在第3和6天，除了450 g/hm2处理外，其他各处理的POD活性均显著高于对照，且在第6天各处理间有显著性差异。在第12天，除了3 600 g/hm2处理的POD显著高于其他各组和对照外，其他各剂量之间无显著性差异，且450～1 800 g/hm2处理的POD活性恢复至对照水平，这说明低剂量（450～1 800 g/hm2）草甘膦胁迫马唐的影响基本消除。

图2　草甘膦胁迫对马唐叶片POD活性的影响

2.3草甘膦胁迫对马唐叶片CAT活性的影响

从图3可知，马唐叶片CAT活性随草甘膦胁迫时间的延长呈先升高后降低的趋势。随胁迫浓度升高而升高。均在草甘膦处理第6天达峰值。在整个实验的过程中，1 800和3 600 g/hm2处理的CAT活性均显著高于其它各处理，且在第6、9和12天他们之间CAT活性无显著性差异，此时，0和450 g/hm2草甘膦处理的CAT活性也无显著性差异；第12天，450和900 g/hm2处理的CAT活性降至接近对照水平，且他们均与对照无显著性差异，这与本研究中SOD、POD活性的变化基本一致。

图3　草甘膦胁迫对马唐叶片CAT活性的影响

2.4草甘膦胁迫对马唐叶片MDA含量的影响

如图4所示，900～3 600 g/hm2草甘膦剂量处理的MDA含量随胁迫时间的延长呈先增加后降低的趋势，且均是第6天 MDA含量达到最大，然后缓慢下降，其中3 600 g/hm2草甘膦处理的MDA含量从实验第6～12天均显著高于其他各处理。这说明草甘膦浓度愈高胁迫导致马唐体内膜质过氧化受损愈严重；草甘膦处理12 d，除3 600 g/hm2草甘膦外，其他各处理的MDA含量均降至对照水平，且他们之间与对照均无显著性差异，这说明450～1 800 g/hm2草甘膦引起马唐质膜受损的情况基本消除，这与本研究中SOD、POD、CAT活性的变化基本一致。

图4　草甘膦胁迫对马唐叶片MDA含量的影响

3　结论与讨论

植物在正常代谢中会产生O2-、·OH、H2O2等活性氧。通常情况下，SOD是细胞内清除活性氧（O2-）系统中的重要酶，对维持植物体内活性氧产生和清除的动态平衡起着重要的作用，从而使植物细胞免受伤害[11]。POD可有效地清除各种逆境胁迫下植物体内产生的过氧化产物（H2O2），以降低其对植物自身的毒害，维持质膜透性及自由基之间的动态平衡，保证植物进行正常生长代谢[12]。SOD活性的升高，导致叶片细胞内积累了大量的H2O2，此时通过增加POD活性将H2O2进行分解，以提高其在逆境下的适应能力。CAT与SOD、POD协同作用，能有效地清除体内的活性氧，维持植物体活性氧代谢的平衡，保护细胞膜的结构不受到伤害。

正常情况下，植物体活性氧的产生和清除两者处于平衡状态；但在逆境胁迫下，这种平衡被打破，从而引起膜受损[13]。植物器官在衰老或逆境条件下，受自由基的毒害会发生膜脂的过氧化作用，MDA是生物膜中不饱和脂肪酸分解后的一种产物，是反应植物遭受逆境伤害程度的良好指标。草甘膦是一种广谱性的除草剂，它能在绿色植物组织内从光系统中产生O2-，且能转化成H2O2和·OH等一系列活性氧，而这些活性氧对细胞本身就有毒害，而SOD、POD和CAT是植物体内活性氧清除系统中最重要的3种酶。因此，POD、SOD和CAT活性以及MDA含量的变化，能反映植物细胞受伤害的程度以及抗氧化胁迫能力的大小[14]，从而反映植物抗性的强弱。相关研究表明，植物SOD、POD、CAT活性和MDA含量随草甘膦的加强或时间的延长，表现为先上升后下降的趋势[8,10]。也有研究表明，草甘膦处理下，MDA含量随草甘膦浓度的增大而降低[15]。

研究表明，不同浓度的草甘膦胁迫均增大马唐叶片SOD、POD和CAT活性以及MDA的含量，第6天达最大值，然后又缓慢下降，至第12天时，450、900和1 800 g/hm2草甘膦处理的 MDA含量和POD活性均降至对照水平，且各处理之间无显著性差异，这说明草甘膦的胁迫使马唐受到了抗氧化损伤，进而大大诱发其保护酶活性的升高从而增强其对逆境的适应能力，尤其是高浓度组。与对照组相比，所有草甘膦处理组的MDA含量都有所增加，说明马唐确实受到草甘膦引起的氧化损伤，但草甘膦胁迫后第12天，草甘膦处理各组的MDA含量均已下降，且450～1 800 g/ hm2草甘膦处理马唐的MDA含量与对照无显著性差异。这说明马唐对草甘膦有一定的抗性，马唐经过一定时间能自行修复，缓解了其质膜过氧化程度，尤其低浓度草甘膦处理马唐所受到的氧化损伤较小且已恢复至正常水平，这与原向阳等[10]的研究结果基本一致。

综上所述，草甘膦胁迫提高了马唐叶片的SOD、POD、CAT活性，增加了MDA的含量；正常条件下，450、900和1 800 g/hm2草甘膦对马唐的伤害可以经过马唐一段时间的生长发育而恢复，进而说明马唐对草甘膦较易产生耐药性。

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（责任编辑：夏亚男）

Influences of Herbicide Glyphosate on Antioxidant Enzyme System and MDA Content of Digitaria sanguinalis

XIA Ai-lian1，JIN Chen-zhong1,2,3，HU Yi-hong1,2,3，LIU Xiao1，ZOU Ting-ting1,2，WANG Yan1,2,3
（1.College of Agriculture and Biotechnology, Hunan University of Humanities, Science and Technology, Loudi 417000, PRC; 2.Hunan Provincial Collaborative Innovation Center for Field Weeds Control, Loudi 417000, PRC; 3.Key Laboratory of Pesticide Harmless Application, Hunan University of Humanities, Science and Technology, Loudi 417000, PRC）

The time-dependent changes of the activities of three antioxidant enzymes and the content of malonaldehyde in Digitaria sanguinalis were studied byspraying different concentrations of glyphosate.The three antioxidant enzymes mentioned above include superoxide dismutase, peroxidase and Catalase.The results showed that compared with the control value, the activities of three antioxidant enzymes and the content of malonaldehyde are somewhat increased during the initial stage after spraying glyphosate.All the indexes peak 6 days after spraying glyphosate.After the ninth day, all the indexes decreased.After the twelfth day, when the glyphosate concentration was 400, 90 and 1 800 g/hm2, the activities of SOD, POD and CAT and the content of MDA in Digitaria sanguinalis decreased to the control level.Under normal circumstances, Digitaria sanguinalis damaged by glyphosate continued to grow over a period of time.At the same time, it also suggested that Digitaria sanguinalis has certain resistance to glyphosate.

glyphosate; Digitaria sanguinalis; antioxidant enzyme system; malondialdehyde

S451

A

1006-060X（2016）11-0024-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.011.008

2016-08-05

湖南省教育厅青年项目（16B137）；娄底市科技计划项目（201304）；湖南人文科技学院产学研合作引导项目（2014CXY06，2013CXY04）；湖南省高校产业化培育项目（13CY030）；湖南省高校创新平台基金（15K066）

夏爱莲（1996-），女，湖南娄底市人，本科生，生物技术专业。

王 艳