紫外分光光度法测定细叶亚菊总黄酮方法的建立

李广彬，马关田，杨相成，海福成，牛海荣

（西北民族大学化工学院，甘肃兰州730124）

紫外分光光度法测定细叶亚菊总黄酮方法的建立

李广彬，马关田，杨相成，海福成，牛海荣

（西北民族大学化工学院，甘肃兰州730124）

目的：建立紫外分光光度法测定细叶亚菊总黄酮含量的方法.方法：对芦丁标准对照品和细叶亚菊提取液用4种显色方法进行全波长扫描，每种显色方法分别确定一个或两个波长.在确定的各波长下，以芦丁对照品建立标准曲线，并测定细叶亚菊总黄酮含量.结果：确定了细叶亚菊总黄酮的含量测定方法，以芦丁为对照品，检测波长为362.0 nm，显色剂为AlCl3－CH3OH.在此条件下测得的精密度RSD为1.11%，重复性RSD为1.08%，稳定性RSD为0.84%，加样回收率为98.70%.结论：该显色方法操作简便、精密度高、重复性好、稳定性强、回收率好.

细叶亚菊；总黄酮；芦丁；显色方法

细叶亚菊（Ajania tenuifolia）为菊科（Asteraceae）亚菊属（Ajania Poljak）植物.分布于中国大陆的西藏东部、青海、甘肃中部、四川西北部以及印度西北部等地区，生长于海拔2 000m至4 580m的地区，常生于山坡草地，是藏医常用草药［1］.味苦、性温而平、具有止血、消肿等功效，尤其对疮伤、肾病有益.细叶亚菊中含有绿原酸、挥发油和黄酮类化合物等活性物质［2－4］，其中黄酮类化合物具有镇静、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗辐射、利胆、强心、镇痛、抗衰老、免疫调节和抗肿瘤等作用［5］.本文考察了紫外分光光度法测定细叶亚菊总黄酮的显色剂和检测波长，确立了含量检测方法，以期为细叶亚菊总黄酮的开发利用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

细叶亚菊，2016年6月采自甘肃兰州城关区，经鉴定为亚菊属植物细叶亚菊Ajania tenuifolia，干燥粉碎过80目筛.

芦丁为纯度≥99%的标准对照品（中国药品生物制品检定所），其他试剂均为上海士锋生物科技有限公司生产的分析纯，水为蒸馏水.

1.2 仪器与设备

AHK-4A型手提式粉碎机（广州市旭朗有限公司），标准药典筛（浙江五四仪器公司），DHG-9075A型干燥箱（上海恒仪公司），AB204-S型万分之一分析天平（瑞士），SK82002H型超声仪（上海科导超声仪器公司），Analytlk jena specord 50紫外可见分光光度仪（美国热电公司）.

1.3 方法

1.3.1 细叶亚菊总黄酮提取液的制备［6］

精确称取细叶亚菊粉末50 000g，加入30mL 95%乙醇溶液，在常温下超声提取，提取功率为500 W，提取时间为60min，用布氏漏斗抽滤并收集滤液于50mL容量瓶中.

1.3.2 显色方法

直接显色法：准确移取提取液0.2mL于10mL容量瓶中，加入95%乙醇并定容至刻度线，静置5 min后测吸光度.A1Cl3–CH3OH显色法［7］：准确移取提取液0.2mL于10mL容量瓶中，加入0.01 mol／mL的A1Cl3–CH3OH溶液并定容至刻度线，静置10min后测吸光度.KOH显色法［8］：准确移取提取液0.2mL于10mL容量瓶中，加入1mL 95%乙醇摇匀，加入0.5mL 10%氢氧化钾，充分摇匀.静置5min后用95%乙醇定容至刻度线，静置5min，测吸光度.NaNO2–A1（NO3）3显色法［9］：准确移取0.2mL提取液于l0mL容量瓶中，加入1mL蒸馏水，混匀后加入0.5mL5%NaNO2溶液.静置5min后，加入0.5mL10%A1（NO3）3溶液.静置5min后，加入2.5mL5%NaOH溶液，摇匀后用蒸馏水定容至刻度线，静置10min，测吸光度.

1.3.3 波长扫描

将细叶亚菊乙醇提取液和芦丁标准品分别按1.3.2的显色方法进行显色反应，在200nm～700nm波长范围内扫描最大吸收波长，最后每种显色剂选取1至2个较为合适的波长.

1.3.4 标准曲线

在1.3.3中确定的各波长下，用芦丁标准品在加入对应的显色剂显色后，分别建立标准曲线.

1.3.5 精密度

准确移取5份0.2mL提取液，按1.3.2所述四种显色方法进行显色，在确定的各波长下测吸光度，计算RSD值.

1.3.6 重复性

准确称取5份细叶亚菊粉末，质量为5g，按1.3.1所述方法制备细叶亚菊总黄酮提取液，分别移取0.2mL提取液按1.3.2所述四种显色方法进行显色，在确定的各波长下测吸光度，计算RSD值.

1.3.7 稳定性

准确移取0.2mL提取液，按1.3.2所述四种显色方法进行显色，在确定的各波长下测吸光度，每隔5min测1次，测5次，计算RSD值.

1.3.8 回收率

以95%乙醇配制0.3mg／mL芦丁对照品溶液，取0.1mL细叶亚菊乙醇提取液和0.1mL芦丁对照品溶液分别按1.3.2所述四种显色方法进行显色，在确定的各波长下测吸光度，计算回收率.

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的确定

细叶亚菊总黄酮提取液在四种显色剂的作用下进行扫描，扫描结果如图1、图2、图3、图4所示.由于在各显色剂的作用下，细叶亚菊总黄酮的吸光度在200nm～220nm时波动幅度较大.因此，根据数据显示，确定直接显色法、A1Cl3–CH3OH显色法、KOH显色法、NaNO2–Al（NO3）3显色法分别在250nm～700nm范围内选择波长，所选的波长分别为259nm、362nm、398nm、275.0nm、402nm、351 nm.

2.2 四种显色法下两种对照品标准曲线的建立

在四种显色剂作用及对应扫描各波长下，共做出6条标准曲线，相关性系数R2≥0.99，表明标准曲线具有良好的线性关系.因此，通过标准曲线方程能较准确地算出所测物质的浓度，具体方程如表1所示，方法学验证结果见表2.

由表2可知，NaNO2－Al（NO3）3显色法在351.0nm处精密度和重复性偏大，回收率差，故此法不适用.KOH显色法在275.0nm和402.0nm处精密度和重复性差（RSD＞3.5%）.用此法测出的结果波动幅度比较大.因此，此法也不适用.直接显色法在336.0nm处重复性差，回收率偏大，故也不适用.AlCl3－CH3OH显色法在398.0nm处重复性和回收率差，但在362.0nm处精密度、稳定性、重复性均较好（RSD＜2.5%），回收率也较好.因此细叶亚菊总黄酮较佳的测定方法为：检测波长为362.0nm，显色剂为AlCl3－CH3OH.

图1 直接显色法

图2 AlCl3–CH3OH显色法

图3 KOH显色法

图4 NaNO2–A1（NO3）3显色法

表1 四种显色方法的标准曲线

表2 方法学验证结果

3 结论

本研究采用紫外可见分光光度法建立了一种快速简便的测定细叶亚菊总黄酮含量的方法，即以芦丁为对照品，在362.0nm处用AlCl3－CH3OH显色检测.在此条件下精密度RSD值为1.11%，重复性RSD值为1.08%，稳定性RSD值为0.84%，回收率为98.70%，这些数据为细叶亚菊的进一步开发利用提供了理论依据.

［1］甄润德，张树源，白雪芳，等.细叶亚菊挥发油中抑制垂穗披碱草的化合物的分离与鉴定［J］.植物生理学报，1996，03：311-314.

［2］张占欣.三种菊科植物和一种玄参科植物化学成分及其生物活性研究［D］.兰州大学，2008.12：263.

［3］张毕阳.高山寒漠带黄花蒿和细叶亚菊挥发油成分的提取和研究［D］.甘肃农业大学，2013.04：44.

［4］薛敬，卢永昌，薛楠.HPLC测定细叶亚菊中的绿原酸［J］.华西药学杂志，2010，01：74-75.

［5］吴聪华，程华，李琳玲，姜德志，袁红慧，程水源.药用植物黄酮类化合物的提取方法［J］.武汉工程大学学报，2011，09：34-38.

［6］朱卫东，浦俊燕，钟扬.细叶亚菊乙醇提取物体外抗氧化活性研究［J］.西藏科技，2016，04：74-77.

［7］董怡，林恋竹，赵谋明.光果甘草叶总黄酮测定方法［J］.食品科学，2013，34（6）：195-198.

［8］钟世安，李维，乔蓉，等.分光光度法测定柚皮中黄酮类化合物［J］.光谱实验室，2007，24（04）：597-601.

［9］旷春桃，李湘洲，汪玉霞，等.大叶冬青叶中总黄酮测定方法和提取工艺研究［J］.食品科学，2009，30（06）：49-51.

TQ9；Q939.9

A

1009-2102（2016）03-0007-04

2016-08-02

西北民族大学国家级大学生创新创业训练计划资助项目（201610742061）.

李广彬（1994—），男，河北衡水人.