海分枝杆菌ppk基因的生物学功能研究

祝 琳 施旭骏 高 谦

(复旦大学基础医学院医学分子病毒学教育部/卫生部重点实验室 上海 200032)



海分枝杆菌ppk基因的生物学功能研究

祝 琳 施旭骏 高 谦△

(复旦大学基础医学院医学分子病毒学教育部/卫生部重点实验室 上海 200032)

目的 构建海分枝杆菌(Mycobacteriummarinum)ppk基因敲除株,对其生物学功能进行研究。方法利用基因同源重组技术,构建了海分枝杆菌ppk基因敲除株;使用DAPI染色法检测细菌胞内多聚无机磷酸盐(poly inorganic phosphate,poly-Pi)浓度;比较野生株及突变株在不同环境压力下的生存能力;用野生株和突变株分别感染斑马鱼成鱼,通过观察斑马鱼的存活情况,研究ppk基因对海分枝杆菌毒力的影响。将野生株和突变株分别感染小鼠来源的巨噬细胞系RAW267.4,检测其在巨噬细胞内的增殖。结果ppk突变株胞内poly-Pi浓度明显下降;在斑马鱼成鱼感染模型中出现显著减毒表型;其在小鼠来源的巨噬细胞感染模型中的增殖较野生型菌株明显减弱;在营养缺陷、抗生素(利福平、左氧氟沙星)等环境压力下,其生存能力下降。结论ppk基因影响分枝杆菌在环境压力下的生存,并且在其致病中发挥重要作用。

分枝杆菌; 多聚磷酸盐激酶; 多聚无机磷酸盐

由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染所引起的结核病是一种严重威胁公共卫生安全的传染性疾病。近年来,随着结核病与HIV共感染、耐多药结核分枝杆菌的出现使结核病的控制更为困难[1],亟需探索预防和治疗结核病的新策略。对结核分枝杆菌重要功能基因及细菌-宿主相互作用的深入研究对于开发新的抗结核药物和疫苗具有重要意义。

磷元素是构成生物体的必要元素,多聚无机磷酸盐(poly inorganic phosphate,poly-Pi)是磷元素在生物体内的主要存在形式。poly-Pi是由几个到几百个无机磷酸盐单体通过高能磷酸键聚合而成的线性多聚体,广泛分布于自然界和生物体[2]。poly-Pi可作为信号分子参与细菌对环境压力的应激性应答[3-4]。对大肠埃希菌的研究发现,在压力环境下细菌胞内poly-Pi聚集可以激活RNA聚合酶RpoS,从而增强细菌对压力环境的耐受[5]。此外,细菌蛋白酶体Lon可以与poly-Pi结合,通过降解核糖体蛋白质产生氨基酸来应对营养缺陷[6]。poly-Pi缺失菌株在平台期生长受到抑制,并且对热激、酸性、UV辐射以及氧化应激更敏感[7-10],由此说明poly-Pi在细菌对环境压力的应答中发挥着重要的作用。

由于poly-Pi在细菌生理过程中具有重要的作用,因此其在细菌体内的合成与降解受到精确调控。目前已经发现参与poly-Pi代谢的酶包括多聚磷酸盐激酶(polyphosphate kinase,PPK)、poly-Pi-AMP磷酸转移酶(phosphotransferase,PAP)、多聚磷酸盐外切酶(exopolyphosphatase,PPX)和多聚磷酸盐内切酶(endopolyphosphatase,PPN)[11]。 PAP、PPXs和PPNs均参与poly-Pi的降解:PAP能转移poly-Pi末端磷酸基团至AMP[12];PPX具有外切磷酸酶活性,能将poly-Pi降解成无机磷酸根离子[13-14];PPN具有内切磷酸酶活性,能将poly-Pi降解成短链的寡聚磷酸盐链。PPK与poly-Pi的合成有关:PPK1能催化ATP末端的磷酸基团转移合成poly-Pi[15],即nATP→(poly-Pi)n+nADP;而PPK2是双向酶,催化GTP+(poly-Pi)n-1→GDP+(poly-Pi)n,并且其降解活性显著高于合成活性[16]。不同细菌中PPK蛋白的种类有所不同,在一些细菌中,同时含有PPK1和PPK2 (如结核分枝杆菌、铜绿假单胞菌等)[17];而在另一些细菌中(如大肠埃希菌、海分枝杆菌等)只含有PPK1[16]。

目前在不同分枝杆菌研究中PPK的相关报道显示:耻垢分枝杆菌的ppk1缺失株在氧化应激、表面压力以及缺氧条件下的生存能力减弱[18];在结核分枝杆菌中,ppk1的缺失引起细菌胞内poly-Pi水平显著下降,表现出在平台期、NO压力下和巨噬细胞内的生长缺陷。同时,ppk1敲除株对一线抗结核药物如利福平(rifampin,Rif)、异烟肼更加敏感,并在豚鼠感染模型上的毒力显著减弱[19]。这些研究结果说明poly-Pi对分枝杆菌的生理功能和致病性具有重要的作用。在海分枝杆菌中,PPK1蛋白的功能还不清楚。为探讨PPK在海分枝杆菌中的作用,我们通过基因同源重组技术构建了海分枝杆菌ppk(MMAR_1730)基因的缺失突变株。通过压力实验、耐药性实验、巨噬细胞和斑马鱼感染实验,对PPK在海分枝杆菌中的作用进行了初步的探索。

材 料 和 方 法

菌株和质粒 海分枝杆菌ATCCBAA-535(M菌株)由加拿大多伦多大学的刘军教授馈赠;质粒pPR27由法国巴斯德研究所Gicquel B教授惠赠;绿色荧光质粒pTEC15由美国华盛顿大学Ramakrishnan L教授惠赠;pMV306由伦敦帝国学院的 Young D 教授馈赠。

主要试剂和仪器 胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒、质粒抽提试剂盒(天根生化科技);逆转录试剂盒(日本Takara 公司);Cary Eclipse荧光分光光度计(美国Varian 公司);荧光定量PCR仪CFX96(美国Bio-Rad 公司);Nanodrop 2000超微量分光光度计(美国ThermoFisher公司)。

动物和细胞 斑马鱼成鱼于实验室内繁育饲养。小鼠来源巨噬细胞系RAW264.7购自中科院生化所。

细菌培养 大肠埃希菌培养基为LB培养基,37 ℃培养。海分枝杆菌培养基为Middlebrook 7H9肉汤培养基(液体)和Middlebrook 7H10琼脂培养基(固体),32 ℃培养。必要时添加抗生素:卡那霉素40 μg/mL,潮霉素50 μg/mL,Rif 4 μg/mL,左氧氟沙星(lavo-ofloxacin,Levo)10 μg/mL。

海分枝杆菌ppk基因敲除突变株构建 使用经典的同源重组技术,通过pPR27-wasabi质粒进行反向筛选,构建海分枝杆菌ppk基因突变株。原有的pPR27质粒带有2个反向筛选标记:sacB基因及1个分枝杆菌温敏复制起点[20]。但是,海分枝杆菌最适生长温度为32 ℃,无法在39 ℃高温下存活,所以pPR27质粒上的温敏筛选并不适用于海分枝杆菌。因此,我们额外引入了wasabi绿色荧光蛋白来进行敲除菌株的筛选。用引物wasabi_R/wasabi_F从pTEC15质粒上扩增wasabi片段,连接到pPPR27质粒,构建pPR27-wasabi质粒。用引物MMppkKO Fw/MMppkKO Rv(表1)扩增海分枝杆菌ppk基因及其两端各约1 kb的同源区域,连接入T载体中,BglⅡ/PstⅠ酶切,去除ppk基因片段,并胶回收长片段,引物Hyg_Fw/Hyg_Rv PCR扩增hyg基因片段,BglⅡ/PstⅠ酶切后连入上述长片段,将重组质粒SpeI酶切得到含有ppk基因两端同源臂及hyg基因的片段即为等位交换底物(allelic exchange substrate,AES)。将AES 连接入 pPR27_wasabi 质粒(SpeI)中,电转化入海分枝杆菌,涂布于潮霉素 B 抗性的 7H10-OADC 平板上,挑取单克隆培养至对数期,转接后大量培养,制备单细菌(约 5×106CFU),涂布于含10%蔗糖的潮霉素B抗性平板上;通过荧光显微镜进行反向筛选,挑取无荧光单克隆进行 PCR 鉴定。

表1 引物名称和序列

海分枝杆菌ppk基因敲除互补株构建 引物MMppkCO_Fw/ MMppkCO_Rv扩增包含ppk基因编码序列及其上下游序列在内的DNA 片段,PCR产物纯化,回收后的DNA片段及质粒pMV306分别使用相应的限制性内切酶酶切,回收后连接,转化入大肠埃希菌 DH5α并抽提质粒。抽提的质粒经过 PCR鉴定正确后再进行测序鉴定。鉴定正确后分别电转化进入海分枝杆菌,构建海分枝杆菌ppk基因敲除互补株。

海分枝杆菌胞内poly-Pi检测 收集海分枝杆菌,使用100 mmol/L的Tris盐酸缓冲液(pH=7.4)洗涤3次后重悬细菌,使用荧光分光光度计进行测量(海分枝杆菌悬液D600值不低于0.2)。EP管中加入2 mL细菌悬液,再加入1 mmol/L的DAPI溶液20 μL,使其终浓度为10 μmol/L,即刻用锡箔纸包裹,避光混匀5 min;立刻加入干净的透明比色皿,置于荧光分光光度计中进行测量,系统自动记录450～650 nm每1.0 nm的发射光值。选取550 nm处记录值,与测量菌液的D600进行标准化处理后,即可得到每1.0单位D600的菌胞内poly-Pi的相对量。

体外H2O2压力实验 细菌于7H9-OADC培养基中培养至对数生长期(D600=0.5～1.0),常温下10 528×g离心5 min,收集细菌并用玻璃珠震荡打散成单细菌,PBS洗涤2次后调整D600至0.3,以终浓度为 10 mmol/L H2O2处理2 h,同时设置未处理对照组,对细菌进行铺板计数,比较野生株及突变株对H2O2的敏感性。

体外营养缺陷实验 细菌于7H9-OADC培养基中32 ℃培养至对数生长期(D600=0.5～1.0),常温下10 528×g离心5 min,收集细菌并用玻璃珠震荡打散成单细菌,使用PBS-Tween 80洗涤细菌3次后,重悬于PBS-Tween 80,将单细菌悬液的D600值调整至0.1,按1∶10稀释至0.01。将细菌悬液移入透气培养瓶中,32 ℃旋转培养(100 r/min)。并于2、4、6天后收集100 μL细菌悬液,铺板计数。

体外十二烷基硫酸钠实验 细菌于7H9-OADC培养基中32 ℃培养至对数生长期(D600=0.5～1.0),常温下10 528×g离心5 min,收集细菌并用玻璃珠震荡打散成单细菌,将单细菌悬液的D600值调整至0.02和0.002,分别吸取5 μL菌液悬滴于含有0.02%十二烷基硫酸钠(SDS)的7H10-OADC平板上,于32 ℃培养7天,观察菌落形态。

海分枝杆菌的药敏实验 细菌于7H9-OADC培养基中培养至对数生长期(D600=0.5～1.0),常温下10 528×g离心5 min,收集细菌并用玻璃珠震荡打散成单细菌,调整D600至 0.1,加入Rif(终浓度分别为4和10 μg/mL),Levo处理,32 ℃旋转培养(100 r/min)。分别于处理3、7天后收集100 μL细菌悬液,铺板计数。

斑马鱼成鱼腹腔注射感染 制备海分枝杆菌单细菌,将菌液稀释到1×106CFU/mL。成年斑马鱼用0.02%的三卡因溶液麻醉3～5 min。使用无菌HPLC 级微量进样器注射,每条鱼10 μL菌液,即1×104CFU,于泄殖腔附近行腹腔注射;对照组注射相同体积PBS。观察感染后不同时间点的斑马鱼存活状况。

海分枝杆菌在巨噬细胞内的增殖检测 小鼠来源巨噬细胞系RAW264.7采用含10% FBS 的DMEM培养基中,置于37 ℃、0.5% CO2培养箱中培养。胰酶消化细胞,计数细胞并调整浓度为105/mL。将上述细胞悬液加入24 孔培养板中(1 mL/孔),37 ℃、5%CO2培养24 h,使单层细胞贴于板壁上即可应用于侵染实验。制备单细胞悬液,每孔加入1 mL上述菌液,共培养4 h(MOI=1)。在指定时间点去除培养基,每孔加入0.1 mL 0.1%Triton X-100,于32 ℃培养箱中孵育15 min,裂解细胞,胞内的细菌用无菌PBS梯度稀释并铺板,于32 ℃培养,进行CFU计数。

统计学分析 采用Graphpad 5.0软件对所有数据进行统计学处理,差异显著性采用双侧t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

ppk在分枝杆菌中的序列保守度分析 在海分枝杆菌中,ppk基因由MMAR_1730编码。通过生物信息学分析,我们发现,MMAR_1730与结核分枝杆菌Rv2984(ppk1)和耻垢分枝杆菌MSMEG_2391(ppk1)高度同源,其氨基酸序列一致性分别为 89%和94%(图1),提示ppk基因在分枝杆菌中高度保守,因此海分枝杆菌ppk基因很有可能与结核分枝杆菌ppk1发挥相似的功能。

海分枝杆菌ppk基因的敲除与鉴定 为了研究海分枝杆菌中ppk基因的功能及poly-Pi的调控方式,我们使用经典的同源重组技术,通过 pPR27-wasabi质粒进行反向筛选,构建海分枝杆菌ppk基因的敲除菌株。抽提基因组,用ppk敲除鉴定引物1和2进行PCR验证(表1),敲除成功的菌株ppk基因内插入了Hygromycin抗性基因(图2A),经PCR及测序验证后证明海分枝杆菌ppk突变株构建成功(图2B),继续构建ppk基因敲除互补株。使用DAPI-poly-Pi染色法检测细菌胞内poly-Pi水平,结果显示ppk突变株胞内poly-Pi浓度下降至约15% (P<0.01,Student′st检验,图2C),证明PPK在海分枝杆菌中与ploy Pi的合成相关,敲除ppk基因后ploy Pi的浓度明显降低。

ppk基因缺失对压力环境下细菌生存的影响 已知poly-Pi能作为信号分子参与细菌对环境压力的应激性应答[18-19]。为了研究海分枝杆菌ppk基因缺失是否影响细菌在压力环境下的生存,我们分别检测了突变株在H2O2处理和营养缺陷状态下的生存能力,及其对细胞壁裂解剂SDS的敏感性。结果发现,突变株经10 mmol/L H2O2处理2 h后的生存能力较野生株无显著差异(图3A);在PBS模拟的营养缺陷环境中培养6天后,突变株的生存率下降了 60%,而野生株未见明显下降。在Δppk菌株中互补该蛋白使表型差异得以恢复(图3B)。在含有0.02% SDS的平板上,突变株失去了生长的能力,野生株仍然可以正常生长并形成完整的菌落形态(图3C)。以上结果说明PPK对于海分枝杆菌在营养缺陷和细胞壁压力环境下的生存十分重要。

ppk基因缺失增强海分枝杆菌的药敏性 结核分枝杆菌poly-Pi的累积被认为与药物的耐受性相关[19]。为了证实这一点,我们将海分枝杆菌野生株、ppk突变株及互补株分别用Rif和Levo处理。结果显示(图4):用Rif及Levo处理3天后,突变株菌量下调至20%;用Rif处理7天后,突变株菌量下调至10%;用Levo处理7天后,突变株菌量下调至6%。这些结果说明ppk基因的缺失使海分枝杆菌对某些药物更加敏感。

ppk基因缺失对海分枝杆菌在巨噬细胞内增殖的影响 为了进一步研究ppk基因的缺失是否影响分枝杆菌在巨噬细胞内的存活,我们分别用野生株、突变株和互补株感染小鼠来源的巨噬细胞株 RAW264.7,CFU铺板计数结果显示,ppk基因缺失使突变株无法在巨噬细胞内增殖,而互补株使表型差异得以全部恢复(图5)。由此提示PPK对于海分枝杆菌在巨噬细胞内的增殖是必需的。

ppk基因突变株在斑马鱼模型中呈现减毒表型为了进一步研究ppk基因对宿主的致病作用,我们分别用1×104CFU剂量的野生株、突变株及互补株分别感染斑马鱼模型,比较不同菌株的毒力。结果显示,在感染的25天内,对照组(PBS)及突变株组斑马鱼没有出现死亡,而被野生株及互补株感染的斑马鱼在1周后逐渐出现活力降低、腹部肿胀等症状,直至死亡。斑马鱼生存曲线如图6所示,可见野生株和互补株感染的斑马鱼分别从第10天和第11天开始死亡,而被突变株感染的斑马鱼直至观察结束没有出现死亡。这一结果说明ppk基因对于海分枝杆菌的致病十分重要。

A:Schematic representation of MT strains.The region containingppkhas been replaced by the hygromycin cassette allelic exchange substrate.B:The PCR result using WT and MT as the template and usingppkPR1 andppkPR2 as the primer.C:Measurement of intracellular poly-Pi inM.marinum.Poly-Pi concentration was determined by the fluorescence emission of DAPI-poly-Pi complex at 550 nm.AU:Arbitrary fluorescence emission units;WT:Wild type;MT:Mutant type.(1)P<0.01.

图2 海分枝杆菌ppk突变株构建及鉴定

Fig 2 The construction and identification ofppkmutant inM.marinum

A:Survival of WT,MT and complement strain after exposure to H2O2.Aliquots (1 mL) of culture atD600of 0.3 were exposed to PBS(control) or 10 mmol/L H2O2for 2 h at 32 ℃.The cultures were serially diluted and plated onto 7H10+OADC plates and the colonies counted after 7-10 days of incubation at 32 ℃ (P>0.05).B:WT,MT and complement strain were grown in PBS for 7 days at 32 ℃.Mycobacteria CFUs were determined at the indicated time points.Data were generated from 3 independent experiments.(1)P<0.05,Student’sttest.C:The growth of WT,MT and complement strain on 7H9+OADC agar with or without 0.01% SDS were visualized after 7-10 days of incubation.WT:Wild type;MT:Mutant type.

图3 海分枝杆菌对压力环境的敏感性

Fig 3 The sensitivity ofM.marinumto external stress

Different strains were grown atD600of 0.1.These cultures were diluted and exposed to Rif (4 μg/mL) and Levo (10 μg/mL) for 3 or 7 days at 32 ℃.The percentage of survival was measured in the culture after incubation with the drug relative to it before the addition of drug.Data were generated from 3 independent experiments.(1)P<0.05;(2)P<0.01.

图4 海分枝杆菌的药敏性

Fig 4 Drug tolerance ofM.marinum

讨 论

RAW 264.7 cells were co-cultured with WT,MT and complement strain at an MOI of 1 for 4 h at 32 ℃.Data were generated from 3 independent experiments.(1)P<0.01,(2)P<0.001 (Student’sttest).

图5 海分枝杆菌在巨噬细胞内的生存情况

Fig 5 Intracellular survival ofM.marinumin macrophage

The zebrafish were infected with WT,mutant,complent strain and PBS by intraperitoneal injection (for each group,n=30).The injection dose was about 1×104CFU per fish.

图6 斑马鱼感染海分枝杆菌后的生存曲线

Fig 6 Survival curve of the zebrafish infected withM.marinum

在本研究中,海分枝杆菌ppk基因缺失后,细菌在营养缺陷环境中的生存能力显著下降,对Rif和Levo更加敏感。这说明poly-Pi在细菌对环境压力的应答中发挥重要的作用。我们还发现ppk突变株在巨噬细胞中的增殖被抑制,在斑马鱼感染模型上呈现完全减毒表型,这些都提示ppk基因对分枝杆菌的致病非常重要。

在结核杆菌中的研究表明,poly-Pi的缺失导致“应激反应调节子”——ppGpp合成基因relA的表达下调和ppGpp含量降低[3],而ppGpp为细菌应答饥饿环境刺激所必需的物质。在大肠埃希菌中的研究表明,在营养缺陷环境下poly-Pi可以和蛋白酶体Lon结合,促进蛋白质降解,产生氨基酸来应对营养缺陷[6]。在海分枝杆菌中,poly-Pi的缺失可能也是通过这些途径导致突变株在这一环境下生存能力下降。

本研究结果显示,海分枝杆菌ppk基因敲除株对SDS更敏感。Sureka等[18]在结核分枝杆菌的研究中发现,SDS处理组与非处理组相比,胞内的poly-Pi浓度也显著增高,敲除结核分枝杆菌ppk1基因,细菌对SDS更敏感。结核分枝杆菌relA基因突变引起众多细菌细胞壁合成相关基因的表达改变,提示分枝杆菌的应激反应与细胞壁的重塑性有关[21]。代谢组学研究发现,结核分枝杆菌体内poly-Pi水平失衡导致脂肪酸合成降低,提示poly-Pi在调控细菌细胞壁合成中发挥重要作用[22]。

本研究发现海分枝杆菌ppk基因敲除菌株对Rif和Levo更加敏感,说明poly-Pi对于细菌应对抗生素压力非常重要。Singh等[19]用Rif、Levo、庆大霉素处理结核分枝杆菌,发现与非处理组相比,ppk基因的表达显著上调,胞内poly-Pi浓度显著增高。由此说明,ppk1基因缺失后,细菌对Rif、异烟肼、Levo等抗生素也更加敏感。对铜绿假单胞菌的研究发现,ppk基因缺失后细菌也对β-内酰胺类抗生素更加敏感。poly-Pi的累积可能诱导细菌进入低代谢状态,而代谢不活跃的细菌更容易在体内形成耐药性。突变株则可能因为poly-Pi的减少而改变细菌的代谢水平,因此更易被药物清除。

在结核分枝杆菌中,PPK1的缺失引起细菌在巨噬细胞内出现生长缺陷以及在豚鼠感染模型上的毒力显著减弱。本研究发现海分枝杆菌ppk基因突变株在巨噬细胞中的增殖被抑制,在斑马鱼感染模型上呈现完全减毒表型,提示ppk基因对分枝杆菌的致病非常重要。但是对于ppk基因的功能及其影响毒力的具体机制,目前尚不清楚。有研究显示poly-Pi调控细菌细胞壁合成[22],由此推测ppk基因缺失可能会导致细菌对宿主的某些杀伤机制更加敏感。

综上所述,本研究证实了ppk对于海分枝杆菌在压力环境下的生存具有重要作用,poly-Pi降低则细菌对药物的敏感性增加,并且与细菌的毒力减弱相关,这些结果都揭示了poly-Pi与分枝杆菌持续性感染之间的联系。ppk缺失引起的poly-Pi水平下降有可能改变ATP水平、NAD+/NADH比值及细菌的氧化还原状态,这些都与细菌的持续性感染相关,在此基础上还需要进一步的实验研究去探索poly-Pi在细菌生理和持续性感染中的作用。

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The biological function of ppk gene in Mycobacterium marinum

ZHU Lin, SHI Xu-jun, GAO Qian△

(KeyLaboratoryofMedicalMolecularVirology,MinistryofEducationandHealth,SchoolofBasicMedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

Objective To construct theppkmutant inMycobacteriummarinum(M.marinum) and to investigate its role in the physiology. Methods Theppkmutant inM.marinumwas constructed by homologous recombination.Intracellular poly inorganic phosphate (poly-Pi) concentration was measured in cell suspensions by using a DAPI-based fluorescence approach.Theninvitrobacterial viability ofppkmutant type and the wild type strain was compared under different stress conditions.Furthermore,invivomycobacterial virulence was checked by infecting the adult zebrafish with mutant and wild type strain.And the intracellular growth ability was investigated by infection of the murine macrophage cell line RAW267.4. Results The intracellular poly-Pi concentration ofM.marinumwas significantly decreased after the deletion ofppkgene.In addition,theppkmutant displayed attenuated phenotype in the zebrafish model.In mice-derived macrophage cell line,the cell proliferation ofppkmutant type declined significantly compared with wild type.Moreover,theppkmutant type was more sensitive to nutrient starvation and antibiotic treatment,including rifampicin and levo-floxacin.Conclusions These results indicate thatppkis involved in stress response and required for mycobacterial virulence.

mycobacterium; polyphosphate kinase; poly inorganic phosphate

Q933

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2016.06.003

2016-01-21;编辑:段佳)

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