蛹虫草子实体中类胡萝卜素的提取及抗氧化活性

邵 颖,陈安徽,刘 辉,胡 模,赵士琛

(江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室,徐州工程学院,江苏徐州 221008)



蛹虫草子实体中类胡萝卜素的提取及抗氧化活性

邵 颖,陈安徽*,刘 辉,胡 模,赵士琛

(江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室,徐州工程学院,江苏徐州 221008)

在比较蛹虫草子实体类胡萝卜素的溶剂提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、酸热提取法的基础上,对蛹虫草子实体中类胡萝卜素的提取工艺进行了优化,并分析了类胡萝卜素的体外抗氧化活性。实验结果表明:酸热提取法是几种常见提取方法中类胡萝卜素提取得率最高的一种方法;酸热法最优提取工艺为:盐酸浓度为1 mol/L,盐酸用量为20 mL/g,酸浸时间为30 min,热处理时间为5 min,蛹虫草中类胡萝卜素的得率达到1387 μg/g。抗氧化实验结果显示:蛹虫草子实体中类胡萝卜素具有较好的体外抗氧化活性,在0～10 mg/mL的浓度范围内抗氧化能力随着类胡萝卜素浓度的提高而增加。4 mg/mL类胡萝卜素的DPPH自由基清除率达到96.57%,类胡萝卜素对铁离子螯合能力的EC50值为3.26 mg/mL,且还显示出了较好的还原能力。

蛹虫草,子实体,类胡萝卜素,提取,抗氧化活性

类胡萝卜素是一类分布广泛的天然色素,其中β-胡萝卜素是其中最常见的一种。β-胡萝卜素是联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会认定的A类营养食品强化剂,摄入机体后会转化为维生素A且不会因为过量摄入而造成维生素A的累积中毒现象[1-2];医学研究发现β-胡萝卜素具有抑制肿瘤形成、抗辐射的作用,并对治疗口腔溃疡、胃溃疡、夜盲症等疾病以及提高免疫能力均具有显著疗效,故美国药典、欧洲药典和英国药典均已将β-胡萝卜素作为药物正式收载[3-4]。现代流行病学研究表明,类胡萝卜素具有抗炎、抗癌、抗氧化活性,能够降低多种癌症、代谢综合征、肥胖、白内障以及黄斑变性等疾病的发病率[5-6]。另有研究发现类胡萝卜素在促进动物生长发育,提高动物繁殖能力和肌肉品质[7]及预防花粉过敏症及过敏性皮炎等方面具有良好效果[8]。目前,类胡萝卜素的保健功效、药用功能及着色性能已使其在保健品、药品、化妆品等领域应用广泛[9]。

蛹虫草是我国传统的可媲美冬虫夏草的药食两用真菌,具有扩张气管、镇静、抗炎、降压、抗病、抗恶性肿瘤等多种药理活性[10-11],其子实体呈现的橙黄色即为其中所含的类胡萝卜素所致[12-13]。目前发现的类胡萝卜素大多为脂溶性物质,但是也有学者从蛹虫草子实体中分离到了强水溶性类胡萝卜素,且其含量占到蛹虫草总类胡萝卜素的86.7%[14]。常见的类胡萝卜素提取方法主要有超临界CO2萃取法、酶法、超声波提取法、微波辅助提取法、有机溶剂提取法、高效液相色谱法等[15-16],但针对不同的提取原料提取方法会有差别。本研究对蛹虫草中类胡萝卜素的提取工艺进行了优化并研究了其体外抗氧化活性,为虫草源天然保健型色素的多领域应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蛹虫草子实体 徐州工程学院发酵工程实验室自行栽培。

丙酮 宜兴市第二化学试剂厂;盐酸 分析纯,上海博河精密化学品有限公司;95%乙醇 宜兴市第二化学试剂厂;1,1-二苯基-2-苦味肼基自由基(DPPH) 美国sigma公司;其它试剂如硫酸亚铁、抗坏血酸等均为国产分析纯。

电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9140 上海精宏实验设备有限公司;超声-微波萃取仪 CW-2000 上海新拓微波溶样科技有限公司;全波长扫描酶标仪Spectra Max M2 美国Molecular device公司;TGL-16G台式离心机 上海安亭科学仪器厂;UV2802PC紫外-可见光分光光度计 上海精密仪器仪表有限公司;梅特勒电子天平 AE2000型 上海分析仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 蛹虫草子实体的采收及粉碎 将成熟蛹虫草子实体自栽种瓶中采收后直接置于40 ℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干,并用高速粉碎机粉碎过40目筛,蛹虫草子实体粉存放于密封袋中避光保存备用。

1.2.2 类胡萝卜素含量测定 参照王陶等[17]的方法并改进。

将提取液适当稀释后,测定溶液453 nm处吸光度,按下式计算类胡萝卜素含量:

类胡萝卜素含量(μg/g)=(Amax×V×D)/(0.16×W)

式中:Amax-453 nm波长处吸光值;V-提取溶剂的用量,mL;D-测定试样稀释倍数;0.16-类胡萝卜素克分子消光系数;W-蛹虫草样品干质量,g。

1.2.3 类胡萝卜素的提取方法选择

1.2.3.1 有机溶剂浸提法 准确称取1.000 g蛹虫草粉末7份,每份分别各加20 mL丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚、石油醚、氯仿于室温条件下避光震荡60 min后于5000 r/min离心10 min,取上清液。上清液适当稀释测定稀释液于453 nm处的吸光值并计算类胡萝卜素的含量。每个处理重复3次。

1.2.3.2 微波辅助提取法 参照张志军[18]的方法并改进。准确称取1.000 g蛹虫草粉末加20 mL丙酮于微波功率200 W时处理3 min,然后于室温条件下避光震荡30 min后于5000 r/min离心10 min,取上清液。上清液适当稀释后测453 nm处吸光值并计算类胡萝卜素的含量。每个处理重复3次。

1.2.3.3 酸热处理提取法 准确称取1.000 g蛹虫草粉末用10 mL浓度1 mol/L的盐酸浸泡40 min,然后于沸水浴中处理4 min,迅速冷却并于5000 r/min离心10 min,用蒸馏水洗涤沉淀2次,残渣加20 mL丙酮,室温避光条件下震荡30 min后于5000 r/min 条件下离心10 min,取上清液。上清液经适当稀释后测定453 nm处吸光值并计算类胡萝卜素的含量。实验重复3次平行。

1.2.3.4 超声波辅助提取法 参照张志军[18]的方法并改进。准确称取1.000 g蛹虫草粉末加20 mL丙酮浸提,超声功率200 W,超声处理30 min后于5000 r/min离心10 min,取上清液。上清液经适当稀释后测定453 nm处的吸光值并计算类胡萝卜素的含量。实验重复3次平行。

1.2.4 类胡萝卜素酸热提取法的优化

1.2.4.1 盐酸浓度的选择 准确称取1 g蛹虫草粉末5份(每份设置3个重复),分别于10 mL浓度为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L的盐酸中浸提40 min,然后于沸水浴中处理4 min,迅速冷却并于5000 r/min离心10 min,用蒸馏水洗涤沉淀2次,残渣加20 mL丙酮,室温避光条件下震荡30 min后于5000 r/min条件下离心10 min,取上清液,经适当稀释后测定453 nm处吸光值并计算类胡萝卜素的含量。

1.2.4.2 盐酸用量的选择 准确称取1 g蛹虫草粉末5份(每份设置3个重复),分别用5、10、15、20、25 mL浓度为0.5 mol/L的盐酸浸提40 min,然后于沸水浴中处理4 min,迅速冷却并于5000 r/min离心10 min,用蒸馏水洗涤沉淀2次,残渣加20 mL丙酮,室温避光条件下震荡30 min后于5000 r/min条件下离心10 min,取上清液,经适当稀释后测定453 nm处吸光值并计算类胡萝卜素的含量。

1.2.4.3 盐酸浸提时间的选择 准确称取1 g蛹虫草粉末5份(每份设置3个重复),分别用15 mL浓度为0.5 mol/L的盐酸分别浸提10、20、30、40、50 min,然后于沸水浴中处理4 min,迅速冷却并于5000 r/min离心10 min,用蒸馏水洗涤沉淀2次,残渣加20 mL丙酮,室温避光条件下震荡30 min后于5000 r/min条件下离心10 min,取上清液,经适当稀释后测定453 nm处吸光值并计算类胡萝卜素的含量。

1.2.4.4 热处理时间的选择 准确称取1 g蛹虫草粉末5份(每份设置3个重复),分别用15 mL浓度为0.5 mol/L的盐酸分别浸提30 min,然后于沸水浴中分别处理0、2、4、6、8 min,迅速冷却并于5000 r/min离心10 min,用蒸馏水洗涤沉淀2次,残渣加20 mL丙酮,室温避光条件下震荡30 min后于5000 r/min条件下离心10 min,取上清液,经适当稀释后测定453 nm处吸光值并计算类胡萝卜素的含量。

1.2.4.5 酸热提取法正交实验 在单因素实验的基础上,设计L9(34)正交实验方案以确定最佳酸热提取工艺。因素水平表见表1。

表1 酸热法正交实验设计方案

Table 1 The factors and levels of orthogonal test of heat acid method

水平因素A盐酸浓度(mol/L)B盐酸用量(mL)C酸浸时间(min)D热处理时间(min)102510253205153043120355

1.2.5 类胡萝卜素的抗氧化活性

表2 溶剂对类胡萝卜素提取率的影响

Table 2 The effect of different solvent on extraction of carotenoids

有机溶剂丙酮甲醇乙醇乙醚石油醚乙酸乙酯氯仿类胡萝卜素含量(μg/g)25017±103--13596±23716480±0747245±20922792±180

注:-表示未检测到类胡萝卜素。

表3 几种常见提取方法的比较

Table 3 Comparison result of common extraction methods

提取方法有机溶剂法微波提取法酸热提取法超声波法色素含量(μg/g)24867±273c29024±681d128995±936a30328±405b

注:a、b、c、d表示四种提取方法在95%置信度下的显著水平分析。1.2.5.1 DPPH自由基清除活性分析 参照Wu[19],将类胡萝卜素稀释至不同的质量浓度,制备成样品溶液。分别量取各样品溶液样液1.5 mL,加入1.5 mL含0.2 mmol/L DPPH的95%(v/v)乙醇,摇晃均匀,置于常温,遮光处理30 min,再于波长517 nm处检测它的吸光度值。

清除率计算公式如下:

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式中:Ac-为对照组吸光度,1.5 mL蒸馏水加1.5 mL含0.2 mmol/L DPPH的95%乙醇;Ai-为样品组吸光度,1.5 mL样品液加1.5 mL含0.2 mmol/L DPPH的95%乙醇;Aj-为空白组吸光度,1.5 mL样品液加1.5 mL 95%乙醇。

1.2.5.2 铁离子螯合能力的测定 参照武守华等的文献[20]。量取2 mL各质量浓度的样液,加入0.1 mL 5 mmol/L的氯化亚铁,然后再加入0.2 mL 5 mmol/L Ferrozine,混匀,然后在室温下静置10 min,然后加入相同体积的去离子水并在562 nm下检测吸光度。以去离子水作空白调零。吸光值越低代表鳌合能力越好。去离子水为空白对照,阳性对照是EDTA。

按如下公式计算各浓度样液铁离子的鳌合能力:

铁离子鳌合能力(%)=[(A0-A1)/A0]×100

式中:A0-空白对照的吸光度;A1-加有样液或者EDTA后的吸光度。

1.2.5.3 还原力的测定 采用Oyaizu[21]的文献中所提的方法。量取不同质量浓度的样液2 mL,加入2 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH6.6),再加入2 mL 1%(w/w)的铁氰化钾溶液,震荡,50 ℃水浴20 min后加入10%(w/w)的TCA溶液2 mL,混匀后以3000 r/min离心10 min。离心后,取2 mL的上清液,再加2 mL去离子水和0.4 mL 0.1%(w/w)的FeCl3溶液,震荡,50 ℃热水浴下保持温度10 min,当液体由黄变成蓝时,在700 nm下检测其吸光度,则其还原能力随其样品吸光度变化。空白对照用去离子水替代样液,VC作为阳性对照。

1.3 数据处理方法

采用DPS7.05版软件对实验结果进行统计分析,所有数据均采用均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 类胡萝卜素提取溶剂的确定

选取7种有机溶剂按照1.2.3.1的方法提取蛹虫草子实体中的类胡萝卜素,结果如表2所示。

由实验结果可知,供试的7种有机溶剂中,丙酮最有利于类胡萝卜素的提取,其次是氯仿。类胡萝卜素在不同极性的溶剂中溶解性能不同,所以使用不同的溶剂提取类胡萝卜素其得率会不同。类胡萝卜素为脂溶性成分,所以非极性溶剂的提取效果要优于极性溶剂。虽有报道显示蛹虫草子实体中存在水溶性类胡萝卜素,但在本实验条件下使用甲醇、乙醇等极性溶剂并未提取到类胡萝卜素。所以,后续实验中选择提取效果最优的丙酮作为类胡萝卜素的提取溶剂。

2.2 提取方法的选择

以蛹虫草子实体中类胡萝卜素的提取率为指标,比较了几种常见提取方法的提取效果以选择较优的提取方法。具体的实验结果见表3。

由表3的实验结果可知,酸热提取法更有利于蛹虫草子实体中类胡萝卜素的提取,含量达到1289.95±9.36 μg/g,显著高于其他三种供试方法(p<0.05)。酸热法有效提取类胡萝卜素的原因可能是盐酸及沸水后的冷却处理可有效破坏蛹虫草的细胞壁结构,使得胞内物质得以溶出。超声波和微波辅助提取方法虽然工艺简单并且可以节约提取时间,不会破坏提取物的活性,但其提取效率太低。所以本研究选择酸热法作为最优提取方法。

2.3 酸热提取工艺的优化

2.3.1 单因素实验

2.3.1.1 盐酸浓度的确定 按照1.2.4.1的方法进行实验以考察盐酸浓度对类胡萝卜素提取的影响。具体的实验结果如图1所示。

图1的实验结果显示,当盐酸浓度为0.5 mol/L时,蛹虫草中类胡萝卜素的提取量达到1333.67±6.65μg/g,显著高于其他浓度下的提取量。随着盐酸浓度的提高,类胡萝卜素的提取量却明显下降。所以,本实验条件下选择盐酸的浓度为0.5 mol/L。

图1 盐酸浓度对类胡萝卜素含量的影响Fig.1 Effect of concentration of hydrochloric acidon the content of carotenoids

2.3.1.2 盐酸用量的确定 按照1.2.4.2的方法考察了盐酸用量对类胡萝卜素提取的影响。具体的实验结果如图2所示。

图2 盐酸用量对类胡萝卜素含量的影响Fig.2 Effect of volume of hydrochloric acidon the content of carotenoids

图2的实验结果显示,随着盐酸用量的增加蛹虫草中类胡萝卜素的提取量呈现缓慢增加的趋势,直至盐酸的用量达到15 mL。随后,类胡萝卜素的提取量随着盐酸用量的增加而明显下降。所以,盐酸的最佳用量为15 mL。

2.3.1.3 盐酸浸提时间的确定 在盐酸浓度和用量确定的基础上,考察了盐酸浸提时间对蛹虫草子实体中类胡萝卜素提取的影响。具体的实验结果如图3所示。

图3 盐酸浸提时间对类胡萝卜素含量的影响Fig.3 Effect of immerse time of hydrochloric acidon the content of carotenoids

图4 热处理时间对类胡萝卜素提取的影响Fig.4 Effect of heat treatment timeon the content of carotenoids

由图3可知,随着盐酸浸提时间的延长,蛹虫草中类胡萝卜素的提取量逐渐增加,但浸提时间超过30 min,类胡萝卜素的提取量却显著降低。可能是因为类胡萝卜素自蛹虫草子实体中被提取出来之后较长时间地暴露于空气中被氧化所致。所以本研究选择盐酸浸提的最优时间为30 min。

2.3.1.4 热处理时间的确定 按照1.2.4.4的方法考察了热处理时间对类胡萝卜素提取的影响。实验结果见图4。

由图4可知,蛹虫草经盐酸浸提后,浸提液于沸水中处理时间的长短会影响到类胡萝卜素的提取效果。浸提液在沸水中处理4 min时提取出的类胡萝卜素的含量最高,热处理时间超过4 min提取率显著降低。所以,最佳热处理时间为4 min。

2.3.2 酸热提取法正交实验结果 在单因素实验的基础上对酸热提取法进行正交实验以优化类胡萝卜素的最佳提取工艺。正交实验结果如表4所示。

表4 正交实验结果

Table 4 Result of orthogonal test

实验号A盐酸浓度(mol/L)B盐酸用量(mL)C酸浸时间(min)D热处理时间(min)色素含量(μg/g)11111957212221135313331283421231251522311176623121214731321198832131365933211322Ⅰ/31125000113533311786671151667Ⅱ/31213667122533312360001182333Ⅲ/31295000127300012190001299667R17000013766757333148000

由表4可知:影响酸热法提取结果的主次因素为A>D>B>C,即盐酸浓度>热处理时间>盐酸用量>酸浸时间;最优条件组合为A3B3C2D3,即盐酸浓度1 mol/L、盐酸用量20 mL/g、酸浸时间30 min、热处理时间5 min,在此条件下进行验证实验,蛹虫草子实体中类胡萝卜素提取量为1387μg/g,高于正交实验结果。

2.3.3 蛹虫草子实体中类胡萝卜素的抗氧化活性

2.3.3.1 DPPH自由基清除活性 蛹虫草子实体中提取的类胡萝卜素的DPPH自由基清除活性如图5所示。

图5 蛹虫草中类胡萝卜素对DPPH自由基清除率的影响Fig.5 Effect of carotenoids from Cordyceps Militarieson DPPH scavenging rate

由图5可知,蛹虫草子实体中提取出的类胡萝卜素对DPPH自由基具有明显的清除活性。在一定的浓度范围内,DPPH自由基清除活性随着类胡萝卜素浓度的提高而增强,当类胡萝卜素浓度为4 mg/mL时,清除率达到96.57%。随后,自由基清除率却随着样品浓度的提高而呈现缓慢下降的趋势。

2.3.3.2 铁离子螯合能力 铁离子螯合能力是抗氧化活性评价的重要指标之一。蛹虫草子实体中类胡萝卜素的铁离子螯合能力实验结果如图6所示。

图6 蛹虫草子实体中类胡萝卜素对铁离子的螯合作用Fig.6 Chelating ability of carotenoids on iron ions

由图6可知,铁离子螯合能力随着样品浓度的增加而增加。当类胡萝卜素浓度为4 mg/mL时,铁离子螯合率已达到69.25%,随后螯合率随着样品浓度的增加呈现缓慢上升的趋势。经数据统计分析发现,蛹虫草中提取出的类胡萝卜素对铁离子螯合能力的EC50值为3.26 mg/mL。说明蛹虫草中类胡萝卜素具有较好的铁离子螯合能力,但低于阳性对照EDTA对铁离子的螯合效果。

2.3.3.3 还原力 还原力是一个表明化合物潜在抗氧化活性的重要指标。还原力越强,抗氧化活性越强。

由图7可以看出,在测定的样品质量浓度范围内,蛹虫草子实体中类胡萝卜素的还原能力随着样品浓度的增加而增加。当类胡萝卜素浓度为10 mg/mL,吸光度达到0.4712,且还原力曲线还呈现缓慢上升的趋势,说明类胡萝卜素具有一定的还原能力。但效果明显没有阳性对照VC好。

图7 蛹虫草子实体中类胡萝卜素的还原力Fig.7 Reducing power of carotenoidsfrom the fruiting body of Cordyceps Militaries

3 结论与讨论

研究了蛹虫草子实体中类胡萝卜素的提取工艺。通过比较几种常见的类胡萝卜素的提取方法对蛹虫草子实体中类胡萝卜素的提取效果,发现酸热法显著优于其他提取方法。采用正交实验法优化了酸热法提取工艺,其最佳提取条件为:每g蛹虫草添加浓度为1 mol/L盐酸20 mL浸提30 min后于沸水中热处理5 min,浸提液迅速冷却后于5000 r/min条件下离心10 min取残渣,残渣使用蒸馏水洗涤2次后添加20 mL丙酮,室温避光条件下震荡30 min后于5000 r/min条件下离心10 min。在此提取工艺下,蛹虫草子实体中类胡萝卜素提取量达到1387 μg/g。同样采用酸热法对蛹虫草子实体中的类胡萝卜素进行提取,陈银岳[22]等人提取的类胡萝卜素的平均得率仅为986.05 μg/g,而张志军[18]等人的提取得率却高达2158 μg/g,本研究条件下的类胡萝卜素得率介于二者之间。分析其中的原因可能是由于蛹虫草自身种质的差别,子实体中自身含有的类胡萝卜素含量间的差别造成的,因为不同来源、不同种的蛹虫草中含有的活性成分的种类及含量之间会存在一定的差异。值得对不同区域范围、不同种质资源、不同培养条件下的人工子实体、野生蛹虫草子实体中的类胡萝卜素含量进行系统分析。

以DPPH自由基清除能力、铁离子螯合能力及还原能力为指标对蛹虫草子实体中类胡萝卜素进行了体外抗氧化活性检测。蛹虫草子实体中类胡萝卜素在特定的浓度范围内其抗氧化能力随其浓度的提高而增加。当类胡萝卜素浓度为4 mg/mL时,对浓度为0.2 mmol/L DPPH的清除率达到96.57%,类胡萝卜素对铁离子螯合能力的EC50值为3.26 mg/mL,且本实验条件提取的蛹虫草源类胡萝卜素还显示了较好的还原能力。

本研究从蛹虫草子实体中提取出的类胡萝卜素是具有抗氧化活性的虫草源色素,可以作为天然抗氧化型保健色素被广泛应用,具有巨大的应用前景。

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Optimization of extraction process and antioxidant activity of carotenoids from fruiting body ofCordycepsMilitaris

SHAO Ying,CHEN An-hui*,LIU Hui,HU Mo,ZHAO Shi-chen

(Jiangsu Key Construction Laboratory of Food Resource Development and Quality Safe, Xuzhou Institute of Technology,Xuzhou 221008,China)

OrthogonalexperimentwasusedtooptimizetheextractionprocessofcarotenoidsfromthefruitingbodyofCordyceps Militarisbasedonthecomparisonresultsofsolventextractionmethod,ultrasonicassistedextractionmethod,microwaveassistedextractionmethodandacidheatextractionmethod,andtheantioxidantactivityofcarotenoidswasalsodetected.Theexperimentresultsshowedthattheacidthermalmethodwasbetterthanotherextractionmethods,andtheoptimalextractingconditionsofacidthermalmethodwere:theconcentrationofhydrochloricacidof1mol/mL,theusageofhydrochloricacidof20mLpergramfruitingbody,timeofdigestionof30min,timeofthermaltreatmentof5min.Theyieldofcarotenoidsreachedto1387μg/g.Anti-oxidationexperimentresultsshowedthatcarotenoidsfromfruitingbodyofCordyceps Militarishadbetterantioxidantabilityandtheabilitywasincreasedwithhigherconcentrations.Atconcentrationof4mg/mL,thecarotenoidscoulddecrease96.57%ofDPPHradicalsandvalueofEC50oftheChelatingabilityonironionswas3.26mg/mL.Inaddition,thecarotenoidsofCordyceps Militarisalsorevealedbetterreducingcapacity.

Cordyceps Militaris;fruitingbody;carotenoids;extraction;antioxidantactivity

2016-03-01

邵颖(1979-)，女，博士，副教授，研究方向：微生物资源的开发与应用，E-mail：shyzhbo2005@126.com。

*通讯作者:陈安徽(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：应用微生物学，E-mail:chenah201@163.com。

江苏省科技计划项目(BN2015012)；江苏省高校自然科学研究重大专项(15KJA180008)联合资助。

TS202.3

B

1002-0306(2016)19-0221-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.035