TCA法脱除榛子壳多糖中蛋白质的工艺研究

王 磊，李 健，刘 宁，黎晨晨

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨 150076）

TCA法脱除榛子壳多糖中蛋白质的工艺研究

王 磊，*李 健，刘 宁，黎晨晨

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨 150076）

以废弃的榛子壳为主要原料，先采用水浴浸提的方法对榛子壳的多糖进行提取，再对榛子壳粗多糖溶液进行脱蛋白处理，然后用紫外分光光度计对其进行蛋白吸光度的测定；采用单因素试验和响应面试验，探讨榛子壳粗多糖脱蛋白的研究。三氯乙酸（TCA）法对榛子壳粗多糖溶液进行脱蛋白试验，结果表明三氯乙酸法脱蛋白的最佳工艺参数为三氯乙酸质量分数4.2%，静置时间20.11 min，样液与TCA的体积比2.03∶1；在此条件下得到榛子壳粗多糖中蛋白的脱除率为77.21%，与模型的预测值79.62%基本吻合，说明响应曲面所得数据可靠。

榛子壳；多糖；脱蛋白；响应曲面法

榛子，也叫做山板栗、尖栗或者棰子，是一种十分重要的坚果[1]。它与核桃、扁桃和腰果并列被称为世界上的四大干果，还有“坚果之王”的美誉[2]。榛子具有极高的营养价值和药用价值，其生物活性成分不仅在榛子果仁中，也存在于榛子壳中[3]。现代研究表明，榛子具有提高机体免疫力、降血糖、抑菌和抗氧化等作用，其中明确了多糖物质是其中重要生物活性成分之一。除此之外，多糖还具有抗肿瘤生长、减少化疗毒副作用和镇静安神等功效[4-6]。目前，榛子的应用越来越广泛，造成大量废弃的榛子壳。为了变废为宝，且对榛子壳多糖的研究还处于相对空白阶段，所以提取废弃榛子壳中的多糖具有一定价值。但是，在多糖的粗提物中往往含有大量蛋白质，因此如何尽量多地去除蛋白质而保留多糖的有效成分成为一个有积极意义的研究课题。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

榛子，产自黑龙江省；磷酸（分析纯），西陇化工股份有限公司提供；考马斯亮蓝G-250（分析纯）、牛血清白蛋白（分析纯），合肥博美生物科技有限责任公司提供。

1.2 仪器与设备

HZS-HX型超级恒温水浴振荡器，金坛市友联仪器研究所产品；FA2004B型分析天平，上海越平科学仪器有限公司产品；UV5100B型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司产品；80-2型离心机，上海逸龙科技有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 榛子壳多糖溶液蛋白质含量的测定

采用考马斯亮蓝[7]法对榛子壳粗多糖溶液的蛋白质含量进行测定。

（1）配制标准蛋白溶液和考马斯亮蓝G-250试剂。①标准蛋白溶液的配制：取20 mg的牛血清白蛋白，用蒸馏水定容至100 mL，制成200 mg/L的原液。②考马斯亮蓝G-250试剂的配制：称取100 mg的考马斯亮蓝G-250，溶于50 mL的95%（V/V）乙醇中，再加入85%（V/V）的磷酸100 mL，最后用蒸馏水定容至1 000 mL。

（2）制作榛子壳多糖溶液蛋白质标准曲线。取7支试管，按表1中的数据依次进行取样，然后分别加入配置好的5 mL考马斯亮蓝溶液，静置10 min后于波长595 nm处进行比色，测定榛子壳多糖溶液蛋白质的吸光度并记录数值。

榛子壳多糖溶液蛋白质含量测定取样见表1。

表1 榛子壳多糖溶液蛋白质含量测定取样

（3）样品中蛋白质含量的测定。配制4%的榛子壳粗多糖溶液，吸取1 mL，加入5 mL的考马斯亮蓝溶液，静置10 min，于波长595 nm处进行比色，测定蛋白质的吸光度。

1.3.2 榛子壳多糖溶液脱蛋白的单因素分析

采用TCA法对多糖溶液进行脱蛋白处理。TCA法脱蛋白的单因素包括TCA质量分数、静置时间和样品与TCA的体积比。通过对多糖溶液蛋白质吸光度的测定，得到最优方案。

（1）TCA质量分数对脱蛋白效果的影响。配制质量分数为2%，4%，6%，8%，10%，12%的TCA溶液，分别取5 mL不同质量分数的TCA溶液加入装有10 mL样品的锥形瓶中，静置20 min，离心10 min，得到脱蛋白的多糖溶液。测不同质量分数下的蛋白质吸光度。

（2）静置时间对脱蛋白效果的影响。配制质量分数为4%的TCA溶液，取5 mL溶液加入装有10 mL样品的锥形瓶中，分别静置10，15，20，25，30 min，离心10 min，得到脱蛋白的多糖溶液。测不同静置时间下的蛋白质吸光度。

（3）样品与TCA的体积比对脱蛋白效果的影响。配制质量分数为4%的TCA溶液，分别按样液与TCA的体积比4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3混合，静置20 min，离心10 min，得到脱蛋白的多糖溶液。测样品与TCA的不同体积比下蛋白质吸光度。

1.3.3 榛子壳多糖溶液脱蛋白的响应面试验

根据响应面试验设计原理，以TCA质量分数（X1）、静置时间（X2）、样液与TCA的体积比（X3）3个因素为自变量，以各个单因素的最优工艺参数为中间水平，上下再分别取1个值作为响应面试验的3个水平，采用三因素三水平的响应面分析方法设计响应面试验，并按方程xi=(Xi-x0)/x对自变量进行编码。其中，xi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值，x0为试验中心点处自变量的真实值，x为自变量的变化步长。

响应面因素设计及编码见表2。

表2 响应面因素设计及编码

2 结果与讨论

2.1 榛子壳多糖溶液蛋白质测定标准曲线的绘制

根据表2，于波长595 nm处测定多糖溶液中蛋白质的吸光度，并绘制标准曲线，得回归方程：Y=0.004 92X+0.004 91，R2=0.999 37。

榛子壳多糖溶液蛋白质标准曲线见图1。

图1 榛子壳多糖溶液蛋白质标准曲线

2.2 榛子壳多糖溶液脱蛋白单因素的试验结果与分析

2.2.1 三氯乙酸（TCA） 质量分数对榛子壳多糖溶液中蛋白脱除率的影响结果

TCA质量分数对榛子壳多糖溶液中蛋白脱除率的影响结果见图2。

由图2可知，在相同的条件下，随着TCA质量分数的增加，蛋白脱除率有明显的增加趋势，说明随着TCA质量分数的增加对蛋白质分解有一定的促进作用。当TCA质量分数达到4%时，蛋白脱除率达到最大值；当TCA质量分数继续增加时，蛋白脱除率几乎保持不变，说明质量分数变大，脱除效果几乎保持不变。因此从经济上考虑，TCA质量分数4%对榛子壳多糖溶液脱蛋白较为合适。

图2 TCA质量分数对榛子壳多糖溶液中蛋白脱除率的影响结果

2.2.2 静置时间对榛子壳多糖溶液中蛋白脱除率的影响结果

静置时间对榛子壳多糖溶液中蛋白脱除率的影响结果见图3。

图3 静置时间对榛子壳多糖溶液中蛋白脱除率的影响结果

由图3可知，在相同的条件下，随着静置时间的增加，榛子壳多糖溶液蛋白脱除率逐渐增加，粒子间相互碰撞放出热量，加速反应。当静置时间达到20 min时，榛子壳多糖溶液脱蛋白率达到最大值；之后随着静置时间继续增加时，蛋白脱除率则明显的下降。说明静置时间为20 min时，是榛子壳多糖溶液脱蛋白的最适时间。

2.2.3 样液与TCA体积比对榛子壳多糖溶液中蛋白脱除率的影响结果

样液与TCA体积比对榛子壳多糖溶液中蛋白脱除率的影响结果见图4。

图4 样液与TCA体积比对榛子壳多糖溶液中蛋白脱除率的影响结果

由图4可知，在相同的条件下，随着样液与TCA体积比的逐渐减少，榛子壳多糖溶液蛋白脱除率不断增加；随着体积比增加，反应更加充分。当液品与TCA体积比达到2∶1时，蛋白脱除率也达到最大值；当继续增加样液与TCA的体积比时，脱蛋白率逐渐减少。所以，取样液与TCA体积比2∶1时为榛子壳多糖溶液脱蛋白的最优结果。

2.3 TCA法脱除榛子壳多糖溶液中蛋白质响应面的试验结果与分析

2.3.1 回归模型的建立

由于试验过程中，各因素的作用交互影响，为了全面考察各个因素的影响，在单因素试验的基础上，设计了以TCA质量分数、静置时间、样液与TCA的体积比为因素L9（34）试验。

榛子壳多糖提取率影响的响应面法试验设计见表3。

表3 榛子壳多糖提取率影响的响应面法试验设计

2.3.2 回归方程系数的显著性检验

回归方程系数的显著性分析见表4。

表4 回归方程系数的显著性分析

根据响应面法对试验数据进行回归分析，得到回归方程为：

其中：Y——蛋白脱除率，%；

X1——TCA质量分数，%；

X2——静置时间，min；

X3——样液与TCA的体积比，V∶V。

根据表4回归方程系数的显著性分析数值可知，试验所选用的模型高度显著（p＜0.000 1）。模型一次项X1，X2，X3显著（p＜0.05），模型交互项X1X3显著（p＜0.05）；模型一次项X2和X3不显著（p＞0.05）；模型交互项X1X2不显著（p＞0.05），交互项X2X3不显著（p＞0.05）；模型二次项X，X和X极显著（p＜0.000 1）。

2.3.3 榛子壳多糖溶液脱蛋白的响应面分析

TCA质量分数和静置时间的交互作用对榛子壳多糖溶液蛋白脱除率的影响见图5，TCA质量分数和样液与TCA体积比的交互作用对榛子壳多糖溶液蛋白脱除率的影响见图6，静置时间和样液与TCA的体积比对榛子壳多糖溶液蛋白脱除率的影响见图7。

图5 TCA质量分数和静置时间的交互作用对榛子壳多糖溶液蛋白脱除率的影响

由图5～图7可知，TCA质量分数和静置时间、TCA质量分数和样液与TCA体积比、静置时间和样液与TCA的体积比对榛子壳多糖溶液蛋白脱除率的影响等交互项对TCA法分离纯化榛子壳多糖溶液的蛋白质脱除率表现出了很好的显著性。此外，由图5～图7可知，各个响应曲面均为凸面，表明该模型在试验范围内存在稳定点，且稳定点为最大值。

利用Design Expert软件对试验模型进行分析，得到TCA法脱除蛋白质的最优条件为TCA质量分数4.2%，静置时间20.11 min，样液与TCA的体积比2.03∶1，TCA法脱除榛子壳多糖中蛋白质的脱除率为79.62%。为了方便实际操作，选取TCA质量分数为4%，静置时间为20 min，样液与TCA的体积比为2，在此条件下进行平行验证试验3次，榛子壳多糖中蛋白质的脱除率平均值是77.21%，与模型的理论值79.62%较为接近，表明数字模型对优化TCA法脱除榛子壳多糖中蛋白质的工艺可行。

图6 TCA质量分数和样液与TCA体积比的交互作用对榛子壳多糖溶液蛋白脱除率的影响

图7 静置时间和样液与TCA的体积比对榛子壳多糖溶液蛋白脱除率的影响

3 结论

以榛子壳为主要原料，用TCA试剂对榛子壳的多糖溶液进行脱蛋白处理，进而达到把榛子壳多糖溶液分离纯化的目的，其中用分光光度计分别测量多糖溶液脱蛋白前后的蛋白质吸光度，根据数值的测定得到脱蛋白的最优工艺参数。

结果表明，各因素对榛子壳多糖溶液脱蛋白影响的显著性表现结果为样液与TCA的体积比＞TCA质量分数＞静置时间。通过响应面分析法优化TCA法脱蛋白工艺条件，得到最佳工艺参数TCA质量分数4.2%，样液与TCA的体积比2.03∶1，静置时间20.11 min；在此条件下平行试验3次，得到榛子壳多糖的蛋白脱除率为77.21%，与模型的预测值79.62%基本吻合，数据可靠。

[1]仝梦卓.榛子综合利用的研究 [D].郑州：郑州大学，2014.

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Study on Separation and Purification of Hazelnut Shell Polysaccharide TCA Method

WANG Lei，*LI Jian，LIU Ning，LI Chenchen （School of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin，Heilongjiang 150076，China）

With hazelnut shell as main raw material.First，by using water bath method of hazelnut shell polysaccharide solution extraction.The hazelnut shell polysaccharide solution for deproteinization.The absorbance of protein are determined by spectrophotometer.This experiment adopts three trichloroacetic acid method of hazelnut shell polysaccharide solution and protein.The results show that optimal process parameters for the three.Three the concentration of chlorine acid is 4.0%，and the settling time is 20 minutes，the ratic of sample to 2 is TCA.And response surface experiment，The most optimal results is Three the concentration of chlorine acid is 4.2%，and the settling time is 20.11 minutes，the ratic of sample to 2.03 is TCA.Under these conditions，the hazelnut shell in the coarse polysaccharide protein removal rate is 77.21%.The removal rate of protein in consistent with the model value of 79.59%.Therefore，the response surface data are reliable.

hazelnut shell；polysaccharide；removal of protein；response surface

S664.4

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.11.039

1671-9646（2016）11b-0038-04

2016-09-25

王 磊（1989—），男，在读硕士，研究方向为食品科学。

*通讯作者：李 健（1956—），男，本科，教授，研究方向为食品科学。