菠萝蛋白酶抗过敏效果的研究

陈建平，罗晨阳，钟赛意，秦小明

（广东海洋大学食品科技学院，广东湛江 524088）

菠萝蛋白酶抗过敏效果的研究

陈建平，罗晨阳，钟赛意，*秦小明

（广东海洋大学食品科技学院，广东湛江 524088）

为了对菠萝蛋白酶的抗过敏效果进行研究，采用透明质酸酶体外抑制试验考察菠萝蛋白酶在水解状态和未水解状态下对透明质酸酶的抑制效果，并运用小鼠被动过敏模型试验评价菠萝蛋白酶的抗过敏效果。结果表明，菠萝蛋白酶质量浓度为0.6～3.6 mg/mL时，对透明质酸酶的抑制效果呈正相关；继续增大菠萝蛋白酶质量浓度，对透明质酸酶的抑制效果反而下降。菠萝蛋白酶经水解后发现，当菠萝蛋白酶的水解度为12.3%时，对透明质酸酶的抑制率达到最大为53.5%，对此水解产物进行超滤，发现其抑制效果主要由分子量在8～10 kDa的组分贡献，此组分对透明质酸酶的抑制率达到最大59.6%。经蓝斑抑制试验表明，相比中、高剂量组，低剂量组的菠萝蛋白酶对小鼠皮肤蓝斑的抑制效果最好，抑制率为55.87%，是阳性药物息斯敏的1.06倍。菠萝蛋白酶具有良好的抗过敏效果，为其进一步开发成为抗过敏剂应用于临床提供理论基础。

菠萝蛋白酶；透明质酸酶；抗过敏

菠萝蛋白酶（Bromelain）简称菠萝酶，又称凤梨酵素，是一种从菠萝植株中提取的植物蛋白酶[1]。研究表明，菠萝蛋白酶不是单一的酶类，是具有不同分子量和不同结构的复合酶[2-3]。近年来研究发现，菠萝蛋白酶具有抑制肿瘤细胞生长、免疫刺激作用、预防心血管疾病等功效，广泛应用于医学、食品加工等领域。此外，国外已经把菠萝蛋白酶作为一种治疗过敏的药物进行研制生产，其抗过敏效果与对炎症的治疗效果有密切的关系[4]。然而，国内对于菠萝蛋白酶抗过敏效果的研究却未见报道。

目前，常见的抗过敏研究方法有透明质酸酶体外抑制试验[5-6]、肥大细胞组胺释放试验[7]、被动皮肤过敏试验[8-9]和毛细血管通透性试验[8]等。其中，透明质酸酶体外抑制试验是一种简单有效的测定方法，已经被日本、韩国等国作为大量筛选抗过敏物质的一种手段；而被动皮肤过敏试验的发展，则大大促进了抗过敏药物的研制。采用透明质酸酶体外抑制试验和小鼠被动皮肤过敏试验对菠萝蛋白酶的抗过敏效果进行研究，以期为开发抗过敏剂提供数据参考和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菠萝蛋白酶粉末，湛江市徐闻县提供；透明质酸钾、透明质酸酶和胃蛋白酶，分析纯，Sigma公司提供；对二甲氨基苯甲醛、乙酰丙酮和伊文思蓝，上海紫一试剂厂提供；息斯敏，分析纯，市售；甲醛，分析纯，国药集团上海化学试剂有限公司提供；P-DAB显色剂由0.8 g对二甲氨基苯甲醛、15 mL浓盐酸（36%）和无水乙醇配成。

1.2 仪器与设备

L6型分光光度计，上海仪田精密仪器有限公司产品；HH-W420型恒温水浴锅，常州诺基仪器有限公司产品；JS6型pH计，深圳安科仪器制造厂产品；WD-9417型酶标仪，杭州惠尔仪器制造有限公司产品；SF150型制冰机，上海仪田仪器设备制造有限公司产品。

1.3 不同质量浓度菠萝蛋白酶对透明质酸酶的抑制效果

称取一定量的菠萝蛋白酶粉末，配成质量浓度分别为0.6，0.9，1.2，1.8，2.4，3.6，4.8，7.2 mg/mL的菠萝蛋白酶溶液。将试验分成A，B，C，D 4组，其中A组和B组分别加入菠萝蛋白酶溶液，C组和D组分别加入蒸馏水。然后，向A组和C组分别加入0.5 mL透明质酸酶（500 U/mL），B组和D组分别加入0.5 mL醋酸缓冲液（pH值5.6）。将上述4组分别放在37℃的恒温水浴锅中保温20 min，取出后每组分别加入0.1 mL CaCl2，在37℃恒温水浴锅中保温20 min。取出后A组和C组加入0.5 mL透明质酸钾溶液，B组和D组加入0.5 mL醋酸溶液（pH值5.6），在37℃恒温水浴锅中保温40 min。取出后在室温下放置10 min，然后每组各加入0.5 mL蒸馏水、0.1 mL NaOH（5 mol/L）和0.5 mL乙酰丙酮。先经沸水浴15 min后取出，然后再经冰水浴15 min后取出，在室温放置10 min后，每组各加入1 mL P-DAB试剂，经充分振荡后加入无水乙醇至8 mL，在室温下放置 30 min后，于波长 530 nm处测定吸光度（Elson-Morgan法）[10]。

透明质酸酶抑制率计算公式：

式中：A——（透明质酸酶、样品、透明质酸钾）溶液的OD值；

B——（醋酸缓冲液、样品、醋酸缓冲液）溶液的OD值；

C——（透明质酸酶、蒸馏水、透明质酸钾）溶液的OD值；

D——（醋酸缓冲液、蒸馏水、醋酸缓冲液）溶液的OD值。

1.4 不同水解时间下菠萝蛋白酶对透明质酸酶的抑制效果

首先，将菠萝蛋白酶进行模拟胃液的水解处理，测定在不同时间下菠萝蛋白酶的水解度，并把水解产物作为样品测定其对透明质酸酶的抑制效果；然后，对具有最佳抑制效果的水解产物采用超滤装置进行超滤，测定最佳水解度条件下不同分子量的分解产物对透明质酸酶的抑制率。

1.4.1 不同水解时间下菠萝蛋白酶的水解度测定

称取一定量的菠萝蛋白酶粉末，加蒸馏水进行溶解，配成质量浓度为2 g/L的菠萝蛋白酶溶液，添加盐酸调节pH值为1.5；加入1 mL胃蛋白酶，在37℃恒温水浴锅里进行模拟水解反应；在10～90 min内每隔10 min取样（置于冰水中终止反应)测定其水解度，在90～150 min内每隔30 min取样（置于冰水中终止反应）测定其水解度。

1.4.2 在不同水解时间下菠萝蛋白酶对透明质酸酶的抑制效果测定

称取一定量的菠萝蛋白酶粉末，加蒸馏水进行溶解，配成质量浓度为3.6 g/L的菠萝蛋白酶溶液，添加盐酸调节pH值为1.5；加入1 mL胃蛋白酶，在37℃恒温水浴锅里进行模拟水解反应；在10～90 min内每隔10 min取样（置于冰水中终止反应）；在90～150 min内每隔30 min取样（置于冰水中终止反应），然后对上述样品进行透明质酸酶抑制试验的测定。

1.4.3 在最佳水解度下菠萝蛋白酶经分子膜超滤后其对透明质酸酶的抑制效果测定

称取一定量的菠萝蛋白酶粉末，加蒸馏水进行溶解，配成质量浓度为3.6 g/L的菠萝蛋白酶溶液，添加盐酸调节pH值为1.5；加入1 mL胃蛋白酶，置于37℃恒温水浴锅中反应60 min后取样，置于冰水中终止反应；将样品分别经过3，5，8，10 kDa的分子膜进行超滤后，取出滤液测定其对透明质酸酶的抑制效果。

1.5 小鼠被动皮肤过敏试验

1.5.1 抗血清的制备

取健康昆明小鼠8只，体重18～22 g，磨碎天花粉3.75 mg溶于1.5 mL氢氧化铝溶液中，制成悬浮液，并注射于小鼠2只后脚掌，每只脚掌注射0.05 mL，共0.1 mL，使小鼠致敏。继续正常喂养15 d后，眼球取血，静置0.5 h后，离心取上清液，制成抗血清。

1.5.2 小鼠被动皮肤过敏模型的建立[11]

取健康昆明小鼠50只，体重18～22 g，随机分为高剂量组（1 g/kg菠萝蛋白酶）、中剂量组（0.48 g/kg菠萝蛋白酶）、低剂量组（0.24 g/kg菠萝蛋白酶）、阳性对照（0.01 g/kg息斯敏组）和空白对照组（等体积的蒸馏水）；每组10只试验小鼠，每天灌胃给药1次，连续给药7 d；7 d后，按1.5.1取制备的抗血清，按1∶5（V/V）加生理盐水稀释。取稀释后的抗血清腹腔注射，每腹壁间隔0.2 cm注射2个点，每点注射0.03 mL，然后继续灌胃给药2 d，在最后一次给药48 h后进行尾静脉注射天花粉（天花粉利用1%的伊文思蓝-生理盐水进行稀释），注射0.2 mL（2.5 mg天花粉）；进行抗原攻击；30 min后眼球取血放置于4℃保存；脱臼处死，翻转腹部皮肤，并剪下蓝斑部分，称取0.5 g剪碎，浸泡在 5 mL丙酮-生理盐水中（配比为7∶5），浸泡48 h后取出离心，取上清液于波长610 nm处测定吸光度，计算抑制率，同时做组间比较，评价药物的抗过敏效果。

酶活计算公式为：

2 结果与讨论

2.1 不同质量浓度菠萝蛋白酶对透明质酸酶的抑制效果

将菠萝蛋白酶粉末溶解于蒸馏水中配成不同质量浓度的菠萝蛋白酶溶液，测定其对透明质酸酶的抑制效果。

不同质量浓度菠萝蛋白酶对透明质酸酶抑制率的影响见表1。

表1 不同质量浓度菠萝蛋白酶对透明质酸酶抑制率的影响

由表1可知，在菠萝蛋白酶质量浓度为0.6～3.6 mg/mL内，随着质量浓度的升高，菠萝蛋白酶对透明质酸酶的抑制率呈逐渐升高趋势。当菠萝蛋白酶质量浓度达到3.6 mg/mL时，其抑制率达到最大为39.70%。随后继续增大菠萝蛋白酶的质量浓度，发现对透明质酸酶的抑制率呈下降趋势，可能的原因是菠萝蛋白酶质量浓度在3.6 mg/mL时其在水溶液中的溶解度已经达到饱和，继续添加菠萝蛋白酶，其在水溶液中的溶解度比较低。

2.2 菠萝蛋白酶的水解度测定

菠萝蛋白酶在不同水解时间内的水解度见表2。

表2 菠萝蛋白酶在不同水解时间内的水解度

在0～70 min内，菠萝蛋白酶的水解度随着水解时间的增加而增加；随后继续增加水解时间，菠萝蛋白酶水解度没有明显的提高，基本维持在动态水平状态。

2.3 菠萝蛋白酶在不同水解条件下对透明质酸酶的抑制效果

菠萝蛋白酶在模拟胃液的条件下进行消化水解，在10～90 min内每隔10 min取样，在90～150 min内每隔30 min取样，然后测定其对透明质酸酶的抑制效果。

菠萝蛋白酶在不同水解时间下对透明质酸酶抑制率的影响见图1。

图1 菠萝蛋白酶在不同水解时间下对透明质酸酶抑制率的影响

由图1可知，在0～60 min内，菠萝蛋白酶对透明质酸酶的抑制率随着水解时间的延长而增大，当模拟消化60 min时达到最大抑制率为56.5%；随后延长水解时间，其抑制率呈下降趋势，经过100 min模拟消化后其抑制率的变化趋于平缓。

2.4 菠萝蛋白酶的水解度与其对透明质酸酶抑制率之间的关系

菠萝蛋白酶对透明质酸酶抑制率的影响及其与水解度的关系见图2。

图2 菠萝蛋白酶对透明质酸酶抑制率的影响及其与水解度的关系

由图2可知，在0～60 min内，菠萝蛋白酶的水解度越高，其对透明质酸酶的抑制率就越大。结果表明，菠萝蛋白酶的水解度与菠萝蛋白酶对透明质酸酶的抑制率呈正相关。当模拟消化水解达到60 min时，菠萝蛋白酶的水解度达到11.1%，此时的菠萝蛋白酶对透明质酸酶的抑制率达到最高为53.5%。

2.5 菠萝蛋白酶不同分子量水解产物对透明质酸酶的抑制效果

将具有最高透明质酸酶抑制活性的菠萝蛋白酶水解产物经过3，5，8，10 kDa分子膜进行超滤，对不同分子量的滤液进行透明质酸酶抑制试验。

不同分子量的菠萝蛋白酶水解产物对透明质酸酶抑制率的影响见图3。

图3 不同分子量的菠萝蛋白酶水解产物对透明质酸酶抑制率的影响

由图3可知，分子量在8～10 kDa的滤液对透明质酸酶的抑制率最高为59.6%。

2.6 小鼠被动皮肤过敏试验

不同剂量菠萝蛋白酶对蓝斑抑制率的影响见表3。

表3 不同剂量菠萝蛋白酶对蓝斑抑制率的影响

由表3可知，低剂量组、中剂量组和高剂量组的菠萝蛋白酶对小鼠皮肤蓝斑均表现出一定的抑制效果。有趣的是，随着菠萝蛋白酶给药剂量的增大，其对小鼠皮肤蓝斑的抑制率就越低。造成这种现象的原因可能是高剂量组的菠萝蛋白酶在血液中水溶性低，从而导致其抑制效果要弱于低剂量组的菠萝蛋白酶。而且，低剂量组的菠萝蛋白酶对小鼠皮肤蓝斑的抑制率（55.87%）比阳性对照息斯敏的抑制率（52.55%）高1.06倍，表明菠萝蛋白酶对小鼠皮肤通透性的抑制效果要优于阳性对照药物息斯敏。菠萝蛋白酶对小鼠皮肤蓝斑的抑制率越高，其对小鼠皮肤通透性的抑制效果就越好，越有利于减轻身体局部免疫反应，从而达到抗过敏的效果。综上所述，在一定的剂量范围内，菠萝蛋白酶具有较好的抗过敏效果。

3 结论

运用体外透明质酸酶的抑制试验和小鼠皮肤蓝斑抑制试验来评价菠萝蛋白酶的抗过敏效果，得到的结论如下：

（1） 在0.6～3.6 g/L质量浓度范围内，未水解的菠萝蛋白酶质量浓度与其对透明质酸酶的抑制效果呈正相关；而菠萝蛋白酶经模拟胃液水解60 min后，对透明质酸酶的抑制率最大为56.8%，相比未水解的菠萝蛋白酶，水解后的菠萝蛋白酶表现出更高的抑制活性。进一步对其进行分子膜过滤发现，其抑制活性主要是由分子量在8～10 kDa内的分解产物来贡献，这部分的分解产物对透明质酸酶的抑制率达到59.60%。综上所述，不论菠萝蛋白酶是否水解，其均表现出对透明质酸酶的抑制效果，表明其具有一定的抗过敏效果。

（2）不同剂量的菠萝蛋白酶对小鼠皮肤蓝斑均有一定的抑制效果，通过体内试验进一步验证了菠萝蛋白酶具有一定的抗过敏效果。

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Study on the Anti-allergy Activity of Bromelain

CHEN Jianping，LUO Chenyang，ZHONG Saiyi，*QIN Xiaoming （College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088，China）

In this paper，the anti-allergy activity of bromelain is investigated.The inhibition effect of the bromelain in the hydrolysis and non hydrolytic conditions on the hyaluronidase is investigated using the hyaluronidase inhibition assay in vitro.The anti-allergy activity of bromelain is further evaluated by the passive allergic mouse model in vivo.The results show that in the range of 0.6～3.6 mg/mL，the concentration of bromelain and its inhibitiory effect on hyaluronidase is positive correlation.Further increasing the bromelain concentration resulted in the decrease in its inhibitory effect on hyaluronidase.After hydrolysis of bromelain，we found that when the degree of hydrolysis is 12.3%，inhibition rate of hyaluronidase reached to the maximum of 53.5%.After this hydrolysate is further treated by ultrafitration，the group of molecular weight between 8～10 kDa contributed to the mainly inhibitory effect on hyaluronidase and its inhibition rate reached to the maximum of 59.6%.The results of blue plaque inhibition assay show that compared with the middle and high dose group，the low dose group exhibited the best inhibitory effect on blue plaque，and the inhibition rate reached to 55.87%，which is 1.06 times of the positive drug astemizole.In conclusion，the bromelain possessed good anti-allergy activity，and this study is expected to provide the theoretical basis for its further development of antiallergic agent in clinical application.

bromelain；hyaluronidase；anti-allergy

Q550

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.11.029

1671-9646（2016）11b-0001-04

2016-09-05

广东省高校重大科研项目培育计划（GDOU2013050214）；广东省自然科学基金博士启动项目（2016A030310332）。

陈建平（1986—），男，博士，讲师，研究方向为天然活性物质的生物活性。

*通讯作者：秦小明（1964—），男，博士，教授，研究方向为海洋生物资源高值化利用。