超滤对身痛逐瘀汤活血化瘀效果的影响

刘晓霞，王继龙，魏舒畅，宋晓春，金辉

甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000

超滤对身痛逐瘀汤活血化瘀效果的影响

刘晓霞，王继龙，魏舒畅，宋晓春，金辉

甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000

目的 研究超滤对身痛逐瘀汤活血化瘀效果的影响，考察超滤技术用于身痛逐瘀汤纯化的可行性。方法 以小鼠微血管动静脉管径、小鼠凝血时间、耳廓循环障碍小鼠毛细血管开放量为评价指标，考察身痛逐瘀汤提取液未超滤及不同超滤方法对活血化瘀效果的影响。结果 身痛逐瘀汤具有较好的活血化瘀效果，20、50 nm膜超滤液与未滤液相比其活血化瘀效果无明显差异。结论 超滤技术可用于身痛逐瘀汤的纯化工艺，所选膜孔径应不小于20 nm。

身痛逐瘀汤；超滤；活血化瘀；小鼠

身痛逐瘀汤为临床常用的经典活血化瘀名方，由秦艽、川芎、桃仁、红花、羌活、没药、当归、五灵脂、香附、牛膝、地龙、甘草组成，具有活血祛瘀、祛风除湿、通痹止痛功效，主要用于瘀血夹风湿、经络痹阻造成的肩痛、臂痛、腰腿痛或周身疼痛经久不愈者，临床应用比较广泛[1-2]。目前，该处方在临床上均以汤剂使用，由于服用体积大、杂质多、外观差及使用不方便，不利于临床应用。超滤属膜分离技术，可有效除去中药复方中大分子杂质，改善制剂外观、减小服用剂量。本研究以活血化瘀效果为评价指标，考察身痛逐瘀汤水提取液超滤前后活血化瘀效果的变化情况，研究超滤技术应用于该经典方纯化的可行性，为该方进一步开发提供基础资料。

1 仪器、试药与动物

HH-S型恒温水浴锅，金坛市正基仪器有限公司；L400低速台式离心机，湘仪离心机仪器有限公司；BS1103型Sartorius电子天平，北京赛多利斯天平有限公司；SHZ-DIII型循环水式真空泵，上海予华仪器设备有限公司；SJM陶瓷超滤设备，合肥世杰膜工程有限公司；10、20、50 nm超滤膜，合肥世杰膜工程有限公司；FeriFiux5000激光多普勒微循环系统，瑞典Perimed公司。

秦艽、川芎、桃仁、红花、羌活、没药、当归、香附、牛膝、地龙、甘草药材购于兰州黄河药材市场，经甘肃中医药大学魏舒畅教授鉴定，分别为麻花秦艽Gentiana straminea Maxim.的干燥根、川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎、桃仁Prunus persica（L.）Batsch的干燥成熟种子、红花Carthamus tinctorius L.的干燥花、羌活Notopterygium incisumTing ex H.T.Chang的干燥根茎及根，没药Commiphora myrrha Engl.的干燥树脂、当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根、香附Cyperus L.的干燥根茎、牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根、地龙Pheretima vulgaris Chen的干燥体、甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根茎及根。泊洛沙姆（药用级，南京威尔化工有限公司，批号20130405）。

昆明种小鼠，SPF级，体质量18～22 g，甘肃中药大学实验动物中心，实验动物质量合格证号SCXK（甘）2011-0001。

2 方法

2.1 身痛逐瘀汤的提取

按处方比例称取药材2.0 kg，加入6倍量水，采用共水蒸馏法提取川芎、红花、羌活、没药、当归、香附的挥发油，提取5 h，收集挥发油，得挥发油5.2 mL。另器收集提完挥发油的水提取液，药渣再加8倍量水提取1 h，合并2次提取液。秦艽、桃仁、五灵脂、牛膝、地龙、甘草100 ℃回流提取2次，每次加10倍量水，每次提取1.5 h。将2组提取液合并，300目筛过滤，得总提取液28.6 L，备用。

2.2 身痛逐瘀汤提取液的超滤

取1.6 L上述提取液，3000 r/min离心（水平转子平均半径20 cm）20 min，收集上清液，取样200 mL，测定出膏率。剩余提取液均分为3份，每份9.0 L。分别用10、20、50 nm超滤膜在45 ℃、0.10 MPa压强下超滤，并在截留液体积剩下1.0 L时加水2.0 L稀释截留液，继续超滤，总共稀释3次。最后1次稀释后超滤至截留液体积1.0 L时弃去截留液，收集超滤透过液[3-4]。分别取3种超滤液，取样200 mL，蒸去溶剂，干燥后测定出膏率及除杂率。出膏率（%）＝（提取物质量÷原药材质量）×100%。除杂率（%）＝[（未超滤样品出膏率－超滤样品出膏率）÷未超滤样品出膏率]×100%。

2.3 药效评价用药液的制备

将离心所得上清液及超滤液减压浓缩成浓度为1.0 g原药材/mL的浓缩液，将“2.1”项所得挥发油加入2倍量的泊洛沙姆研匀，再将挥发油与泊洛沙姆的混合物按比例分别加入4种浓缩液中混匀，得到药效评价用药液。药液中泊洛沙姆的浓度为1.04%。

2.4 超滤对活血化瘀作用的影响

2.4.1 小鼠耳廓微循环实验 取小鼠60只，雌雄各半，按体质量、性别随机分成6组，对照组及模型组给予含1.0%泊洛沙姆的生理盐水灌胃，其余4组分别给予“2.3”项下未超滤液及10、20、50 nm超滤的浓缩液0.2 mL灌胃。每日2次，连续7 d，于末次给药后立即腹腔注射20%乌拉坦（0.1 mL/10 g）麻醉，将除模型组外的其余5组小鼠一侧耳廓置微循环显微镜载物台，滴涂液体石蜡，用10×10倍镜、透射光、测微尺测量给药后5、45 min小鼠耳廓微动脉、微静脉管径（测2次）。测量结束后，将模型组及给药组小鼠于耳廓滴加1∶1000肾上腺素0.1 mL/只致微循环障碍，对照组耳廓滴加等体积生理盐水[5-7]。观察造模后15、30 min小鼠耳廓微循环。

2.4.2 小鼠凝血实验 取50只小鼠，按体质量、性别随机分为5组，对照组给予含1.0%泊洛沙姆的生理盐水灌胃，其余4组分别给予“2.3”项下未超滤液及10、20、50 nm超滤浓缩液0.2 mL灌胃，每日2次，连续7 d，于末次给药1.0 h后，用内径1.0 mm毛细玻璃管在小鼠内眦球后采血，测定凝血时间[8]。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 超滤对身痛逐瘀汤出膏率的影响

随超滤膜孔径减小，身痛逐瘀汤水提取液的出膏率依次降低，除杂率提高，见表1。

表1 不同处理方法出膏率、除杂率比较（%）

3.2 超滤对身痛逐瘀汤活血化瘀作用的影响

3.2.1 对小鼠微血管静脉及动脉口径的影响 身痛逐瘀汤未超滤液及20、50 nm超滤液均可明显增大小鼠微血管静脉及动脉管径，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；与10 nm超滤组比较，身痛逐瘀汤50 nm超滤组小鼠微血管静脉及动脉管径显著增大（P＜0.05）。结果见表2、表3。

表2 不同处理方法小鼠微血管静脉口径比较（±s，μm）

表2 不同处理方法小鼠微血管静脉口径比较（±s，μm）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与10 nm超滤组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01（下同）

组别 只数 5 min 45 min对照组 10 32.20±2.68 33.18±2.79未超滤组 10 36.44±2.66 47.21±3.12**△△50 nm超滤组 10 35.78±2.94 45.09±2.77**△20 nm超滤组 10 35.22±2.73 43.78±3.43**△10 nm超滤组 10 33.93±3.06 37.54±3.61

组别 只数 5 min 45 min对照组 10 18.67±2.46 19.22±2.77未超滤组 10 22.61±2.10 26.93±3.06**△50 nm超滤组 10 22.78±2.21 26.23±2.85**△20 nm超滤组 10 21.67±2.54 24.76±2.11*10 nm超滤组 10 20.21±2.97 22.76±2.11

3.2.2 对耳廓循环障碍小鼠毛细血管开放量的影响 身痛逐瘀汤未超滤液及10、20、50 nm超滤液均有增加血管开放量的趋势，未超滤液及20、50 nm超滤液均可显著增加毛细血管开放量，与10 nm超滤组比较差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），见表4。

组别 只数 造模前 造模后15 min 造模后30 min对照组 10 6.22±1.16 6.54±1.16 6.61±1.16模型组 10 6.31±1.12 4.21±1.04 4.15±1.71未超滤组 10 8.69±1.35 6.83±1.22△△6.27±1.32△△50 nm超滤组 10 8.74±1.50 6.79±1.31△△6.41±1.11△20 nm超滤组 10 8.55±1.66 6.43±1.29△6.42±1.34△10 nm超滤组 10 7.39±1.54 5.22±1.41 5.05±1.48

3.2.3 对小鼠凝血时间的影响 身痛逐瘀汤未超滤液及20、50 nm超滤液均可明显增延长小鼠凝血时间，与10 nm超滤组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表5。

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4 讨论

纯化是中药提取物制备过程中的关键环节，由于中药复方成分复杂，其临床疗效是多成分、多靶点整体作用的结果，因此活性成分的组成、含量和各成分之间的比例变化均会影响处方疗效。超滤属于膜分离技术，可通过调节膜孔径截留分子量不同的物质，在中药复方纯化过程中，在选择性除去提取液中大分子惰性物质、有效改善提取物溶剂性和液体产品澄明度的同时保证中药复方活性成分的组成及比例基本不变[4]。

目前中药复方纯化工艺研究多选用某一种或一类化学成分为工艺评价指标，由于评价指标代表性不强、与处方临床疗效之间的关系不明确，使优选所得工艺不能很好保证疗效。本研究采用与身痛逐瘀汤临床作用相关的药效学数据为评价指标，考察超滤技术用于身痛逐瘀汤的可行性，工艺的可靠性优于采用化学指标所得结果。

将身痛逐瘀汤水提液3000 r/min离心旨在除去不溶性杂质，得到澄明的药液。该条件下离心力为500×g，处方中多糖等可溶性大分子成分在低速离心条件下不会沉降，从而保证提取液疗效。结果显示，该水提液有较好的活血化瘀作用。

本研究超滤过程是在较低压力和较高温度条件下进行的，有利于消除浓差极化对超滤过程的影响，尽可能减少活性成分的损失，以便考察超滤技术的可行性。将身痛逐瘀汤水提取液用50、20 nm孔径的超滤膜超滤后活血化瘀作用未见明显差异。但经10 nm超滤膜超滤后活血化瘀作用减弱，与未滤液比较差异有统计学意义。提示用超滤技术纯化身痛逐瘀汤是可行的，但膜孔径不能小于10 nm。

超滤纯化的除杂力度较小，但除掉的是对澄明度、溶解性影响较大的大分子物质，因此对提高制剂的品质有显著意义。20 nm超滤液与50 nm超滤液相比药效略有降低，但未见明显差异；从除杂效果看，20 nm膜超滤略优于50 nm膜，其超滤液的澄明度可能优于50 nm膜超滤液，更有利于液体制剂的制备。

[1] 张永良.身痛逐瘀汤临床应用体会[J].实用中医药杂志,2001,17(2)：41.

[2] 沈翔.身痛逐瘀汤治疗腰腿痛67例疗效观察[J].中医临床研究, 2012,4(18)：14-13.

[3] 魏舒畅,余琰,王志旺,等.补阳还五汤超滤工艺优选条件的评价与优化[J].中成药,2009,31(2)：304-305.

[4] 华耀祖.超滤技术与应用[M].北京：化学工业出版社,2004：184-252.

[5] 陈奇.中药药理研究方法学[M].北京：人民卫生出版社,2011：355-386.

[6] 陈靖,付彦君.身痛逐淤汤活血化淤作用的实验研究[J].医学理论与实践,2013,26(8)：983-984.

[7] 潘媛,彭成,刘建林.川芎定痛颗粒活血化瘀作用的研究[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(7)：174-177.

[8] 丘芬,金钊,闫守霞,等.虎杖五种酒制饮片水提物的活血化瘀作用研究[J].时珍国医国药,2013,24(12)：13903-13904.

Effects of Ultrafiltration Process on Activating Blood and Removing Stasis Efficacy of Shentong Zhuyu Decoction

LIU Xiao-xia, WANG Ji-long, WEI Shu-chang, SONG Xiao-chun, JIN Hui

(Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China)

Objective To study the effects of ultrafiltration process on activating blood and removing blood stasis efficacy of Shentong Zhuyu Decoction; To investigate the feasibility of applying ultrafiltration technology in purifying Shentong Zhuyu Decoction. Methods The mice micro artery and vein diameter, clotting time and opening capillary of auricle microcirculation of mice were used as indexes to observe the effects of different ultrafiltration process on activating blood and removing blood stasis efficacy of Shentong Zhuyu Decoction. Results Shentong Zhuyu Decoction showed satisfying efficacy of activating blood and removing blood stasis. There was no significant difference between the non-ultrafiltration process and ultrafiltration processed by 20 and 50 nm ultrafiltration membranes. Conclusion Ultrafiltration technology can be applied to purifying Shentong Zhuyu Decoction, and the membrane pore size must be more than 20 nm.

Shentong Zhuyu Decoction; ultrafiltration process; activating blood and removing stasis; mice

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.020

R283.5

A

1005-5304(2016)01-0086-03

2015-06-02）

（

2015-06-30；编辑：陈静）

甘肃省高校基本科研费项目（BH2012-018）

魏舒畅，E-mail：wshch006@163.com