HPLC同时测定痛经灵颗粒中3种有效成分含量

李中娥

南阳市食品药品检验所，河南 南阳 473061

HPLC同时测定痛经灵颗粒中3种有效成分含量

李中娥

南阳市食品药品检验所，河南 南阳 473061

目的 建立高效液相色谱法同时测定痛经灵颗粒中丹酚酸B、芍药苷和羟基红花黄色素A含量的方法，为有效控制其质量提供可靠的方法。方法 采用Welchrom C18色谱柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸（B）为流动相梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长为230 nm。结果 丹酚酸B在0.197～1.316 μg范围内呈良好的线性关系（r＝0.999 6），平均回收率为98.72%，RSD＝1.49%；芍药苷在0.158～1.051 μg范围内呈良好的线性关系（r＝0.999 8），平均回收率为99.01%，RSD＝0.92%；羟基红花黄色素A在0.053～0.353 μg范围内呈良好的线性关系（r＝0.999 4），平均回收率为98.34%，RSD＝1.60%。结论 该方法简便、灵敏、准确、重复性好，可用于痛经灵颗粒的质量控制。

痛经灵颗粒；丹酚酸B；芍药苷；羟基红花黄色素A；高效液相色谱法

痛经灵颗粒收载于《中华人民共和国卫生部药品标准•中药成方制剂》第十五册，由丹参、赤芍、香附（醋制）、蒲黄、红花、延胡索、乌药等组成，具有活血化瘀、理气止痛功效，临床用于治疗气滞血瘀所致痛经。该产品现行标准中没有含量测定项[1]，无法有效控制其质量。以往报道多以原儿茶醛或芍药苷等单一成分作为质控指标[2-3]，本研究参考有关文献[4-8]，对样品处理方法和色谱分离系统进行优化，采用高效液相色谱法（HPLC）同时对方中3味主药的特征性活性成分丹酚酸B、芍药苷、羟基红花黄色素A含量进行测定，从而在简化检测步骤、节约检测资源的情况下，更好地控制该药品的质量。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪，配四元梯度泵、G1314F紫外检测器；赛多利斯BP-211D电子天平；KQ-300DE型数控超声波仪（昆山市超声仪器有限公司）。

对照品丹酚酸B（批号111562-201110，含量98.0%）、芍药苷（批号110736-201035，含量96.5%）、羟基红花黄色素A（批号111637-200905，含量91.8%）均购自中国食品药品检定研究院，乙腈（HPLC，Welch Materials Inc.），磷酸（分析纯，天津市福晨化学试剂厂），水为重蒸馏水。痛经灵颗粒（市售）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Welchrom C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～12 min，12%A；12～20 min，12%A→34%A；20～30 min，34%A；30～35 min，34%A→12%A）；检测波长：230 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于4000，各峰之间分离度符合要求。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取羟基红花黄色素A对照品9.62 mg，置50 mL量瓶中，加75%甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀。精密称取丹酚酸B对照品16.78 mg、芍药苷对照品13.61 mg，置25 mL量瓶中，加上述羟基红花黄色素A对照品溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得含丹酚酸B 0.657 8 mg/mL、芍药苷0.525 3 mg/mL、羟基红花黄色素A 0.176 6 mg/mL的溶液（对照品溶液①），精密量取2 mL，置20 mL量瓶中，加75%甲醇至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 取本品适量，研细，精密称取0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加75%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声提取（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用75%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，用微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 阴性对照溶液制备 按处方制法分别制备不含丹参、赤芍和红花的阴性对照样品，按供试品溶液制备方法分别制成阴性对照溶液。

2.3 专属性试验

吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件分别进样，结果供试品色谱中，在与丹酚酸B、芍药苷和羟基红花黄色素A对照品色谱相同的保留时间处有色谱峰，与其他组分能达到良好分离，分离度均＞1.5，理论塔板数分别为8326、10 967、13 980。阴性对照色谱中，在与丹酚酸B、芍药苷和羟基红花黄色素A对照品色谱峰相应的位置上无干扰峰，说明供试品溶液中的其他成分对测定结果无影响，见图1。

2.4 线性关系的考察

精密量取“2.2.1”项下对照品溶液① 0.3、0.6、0.9、1.2、1.6、2.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加75%甲醇至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件测定，以浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，分别绘制标准曲线，得回归方程。丹酚酸B：Y＝10.866X－1.100 9，r＝0.999 6（n＝6）。芍药苷：Y＝7.621X＋0.292 1，r＝0.999 8（n＝6）。羟基红花黄色素A：Y＝11.834X－0.352 8，r＝0.999 4（n＝6）。结果表明，丹酚酸B在0.197～1.316 μg、芍药苷在0.158～1.051 μg、羟基红花黄色素A在0.053～0.353 μg范围内呈良好的线性关系。

图1 痛经灵颗粒中3种有效成分HPLC图

2.5 精密度试验

取“2.2.1”项下对照品溶液，进样量10 μL，连续进样6次，测定峰面积，结果丹酚酸B、芍药苷和羟基红花黄色素A的峰面积RSD分别为0.97%、1.56%、1.22%，表明精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批号样品6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定每份样品中3种成分含量，结果丹酚酸B、芍药苷、羟基红花黄色素A的含量RSD分别为1.33%、0.91%、1.52%，说明重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一份供品溶液，分别在0、3、6、9、12 h进样测定峰面积，结果丹酚酸B、芍药苷、羟基红花黄色素A的峰面积RSD分别为1.59%、1.13%、1.27%。表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

精密称取已测得含量（丹酚酸B 2.628 mg/g，芍药苷2.083 mg/g，羟基红花黄色素A 0.706 mg/g）的痛经灵颗粒6份，每份0.25 g，分别精密加入“2.2.1”项下对照品溶液①各1.0 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.9 样品测定

按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，测定来自云南、河北、陕西、吉林不同厂家共12批样品中3种成分的含量，结果见表2。

根据12批样品所测得的结果，可看出不同厂家不同批次所含3种成分的含量有所差异，质量参差不齐，其中尤以羟基红花黄色素A的含量差别为大，可能与红花药材较贵且在成药质量标准中较少被检测有关，因此很有必要对这3种成分合理定量，从而更好地监管该药品的质量。

表212 批样品中3种成分含量测定结果（mg/g，n＝3）

3 讨论

本试验比较了30%乙醇、甲醇、50%甲醇及75%甲醇几种溶剂的提取效果，结果以75%甲醇提取所得可更好兼顾3种成分的含量，故以75%甲醇为提取溶剂。因丹酚酸B对热不太稳定，故未采用回流而采用超声方式提取，试验发现超声提取25 min后，3种成分的含量无明显增加，所以将提取时间定在30 min。

在多成分同时检测中，很多需要采用转换波长的方式以取得好的效果[5-6]。本试验发现，以芍药苷的最大吸收波长230 nm作为单一检测波长，其他2种成分亦吸收稳定，响应信号良好，线性范围满足需要，故采用单波长检测，便于该方法更广泛地应用。

[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：中药成方制剂 第十五册[M].1997：209.

[2] 任红兵.痛经灵颗粒质量标准研究[J].现代中药研究与产践,2011, 25(2)：76-79.

[3] 章常华,曾宗浪,施宏斌,等.痛经灵颗粒质量标准研究[J].亚太传统医药,2008,4(4)：34-37.

[4] 严红.HPLC法同时测定中药多种有效成分含量的应用[J].天津药学, 2010,22(1)：67-70.

[5] 厉瑶,郭正泰,龚行楚,等.丹参红花混煎液中丹参素、羟基红花黄色素A、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B的HPLC测定方法[J].中国中药杂志,2013,38(11)：1653-1656.

[6] 刘敏彦,赵韶华,王玉峰.超高效液相色谱法同时测定参松养心胶囊中8种活性成分的含量[J].中国医院药学杂志,2014,34(6)：435-438.

[7] 贾歆.HPLC同时测定尿塞通片中的芍药苷、丹酚酸B及隐丹参酮[J].华西药学杂志,2014,29(1)：77-79.

[8] 王亚洲.HPLC法同时测定蝎龙酒中芍药苷、羟基红花黄色素A和阿魏酸[J].中成药,2012,34(10)：1925-1928.

Simultaneous Determination of Three Active Ingredients in Tongjingling Granules by HPLC

LI Zhong-e (Nanyang Institute for Food and Drug Control, Nanyang 473061, China)

Objective To establish a simultaneous determination method for Salvianolic acid B, Paeoniflorin and Hydroxysafflor yellow A in Tongjingling Granules; To provide a reliable method for effective quality control. Methods The determination was performed on a Welchrom C18column with acetonitrile (A) - 0.1% phosphoric acid (B) as the mobile phase in gradient elution mode at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 230 nm. Results Salvianolic acid B presented in a good linear relation in the range of 0.197–1.316 μg, and the average recovery rate was 98.72% with RSD 1.49%; Paeoniflorin presented in a good linear relation in the range of 0.158–1.051 μg, and the average recovery rate was 99.01% with RSD 0.92%; Hydroxysafflor yellow A presented in a good linear relation in the concentration range of 0.053–0.353 μg, and the average recovery rate was 98.34% with RSD of 1.60%. Conclusion This method is simple, sensitive, accurate and with good reproducibility, which can be used for quality control of Tongjingling Granules.

Tongjingling Granules; Salvianolic acid B; Paeoniflorin; Hydroxysafflor yellow A; HPLC

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.025

R284.1

A

1005-5304(2016)01-0103-03

2014-12-02；编辑：陈静）